泛素偶联酶UBE2C/UbcH10荧光蛋白表达载体的构建及肝癌细胞中的表达

目的构建人泛素偶联酶UBE2C/UbcH10荧光蛋白真核表达载体,并转染肝癌细胞,筛选建立稳定转染细胞株。方法从构建好的pMD19-T/UbcH10载体中PCR扩增UbcH10基因,PCR产物双酶切后克隆入pEGFP-N1真核表达载体中,构建真核表达载体pEGFP-N1/UbcH10,进行双酶切和测序鉴定。将构建好的真核表达载体pEGFP-N1/UbcH10和空载体pEGFP-N1利用脂质体Lip2000TM分别转染进入肝癌细胞SMMC7721中,建立肝癌细胞SMMC7721的G418细胞死亡曲线,选择G418的筛选浓度,经G418结合荧光显微镜观察筛选稳定转染细胞。将筛选获得的肝癌细胞进行有限稀释法单克隆化,收集单个细胞克隆扩大培养备用。结果经双酶切和测序鉴定,带有荧光蛋白标记的真核表达载体pEGFP-N1/UbcH10构建成功,经脂质体介导真核表达载体pEGFP-N1/UbcH10和空载体pEGFP-N1成功转入肝癌细胞SMMC7721中,经800μg/mL G418筛选并进行单克隆化获得稳定转染的细胞株SMMC7721-pEGFP-N1和SMMC7721-pEGFP-N1/UbcH10,阳性转化率达到94%以上。结论人泛素偶联酶UBE2C/UbcH10稳定高表达肝癌细胞株的建立,为该蛋白在肝癌发生发展过程中的具体作用机制的研究奠定了基础。

泛素偶联酶UBE2C/UbcH10在消化道肿瘤中的研究进展

素偶联酶UBE2C是泛素—蛋白酶体通路(UPP)中重要的成员之一,UBE2C/UbcH10的过表达不仅与恶性肿瘤的病因学有直接关系,并且与恶性肿瘤的发展和预后有着密切的关系,该文就泛素偶联酶的结构功能、作用机制及其在消化道肿瘤中的研究进展作一综述,为其用于消化道肿瘤病因学研究提供理论基础。