人UCA1基因转录调控的生物信息学分析与鉴定

目的生物信息学分析与鉴定人类膀胱癌特异性表达的UCA1基因转录调控作用原理。方法运用CpG岛预测软件EMBOSS CpGplot、CpG Island Searcher、Methprimer、CpG finder对UCA1基因启动子CpG岛进行分析。利用转录因子预测软件MatrixCatch和TFSEARCH对UCA1基因核心启动子区可能结合的转录因子进行分析。染色质免疫沉淀技术对所预测到的转录因子进行分子生物学实验验证。结果 CpG岛预测发现UCA1基因全长启动子区中不存在CpG岛,因此UCA1基因属于组织特异性基因与前期研究报道结果一致。生物信息学预测及筛选发现UCA1基因核心启动子存在4个与肿瘤关系密切的转录因子。根据预测结果选取2个转录因子利用染色质免疫沉淀实验鉴定,确定1个转录因子可与UCA1基因核心启动子区结合。结论 UCA1基因启动子区无CpG岛存在,该基因核心启动子区可能与多种转录因子结合,并确定转录因子c-Myb可以与UCA1基因核心启动子区结合。

长链非编码RNA尿路上皮癌相关1基因与脓毒症患者炎症因子严重程度及预后的关系

目的探索长链非编码RNA尿路上皮癌相关1(lncRNA UCA1)基因与脓毒症患者炎症因子、严重程度及28天死亡关系。方法收集2022年1月至2023年12月期间中国人民解放军联勤保障部队第九六○医院收治的174例脓毒症患者临床资料。按照与脓毒症患者性别相同,年龄相差1岁之内1∶1配对收集同期健康体检者作为对照组。通过实时荧光定量(RT-qPCR)法检测外周血单核细胞中lncRNA UCA1水平。酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、IL-17、细胞间黏附分子1(ICAM1)和血管细胞黏附分子1(VCAM1)水平。使用COX风险比例回归模型分析影响脓毒症患者28天病死率相关危险因素。绘制受试者工作特征(ROC)曲线,评估独立危险因素预测脓毒症患者28天死亡的效能。结果与对照组比较,脓毒症患者lncRNA UCA1水平更高(Z=76.235,P<0.001)。脓毒症患者lncRNA UCA1与TNF-α(r=0.384)、IL-6(r=0.308)、IL-17(r=0.472)、ICAM1(r=0.361)和VCAM1(r=0.492)水平、APACHEⅡ(r=0.393)和SOFA评分(r=0.427)均呈正相关(P均<0.001),而对照组中lncRNA UCA1与上述参数均无相关性(P均>0.05)。LncRNA UCA1水平升高(HR=2.186,P=0.007)、年龄增加(HR=1.245,P=0.011)、真菌感染(HR=19.259,P=0.010),C-反应蛋白(CRP)升高(HR=1.334,P=0.036)及APACHEⅡ评分增加(HR=1.245,P=0.017)是脓毒症患者28天死亡的独立危险因素。ROC曲线分析可见lncRNA UCA1(AUC=0.757)、APACHEⅡ评分(AUC=0.865)、CRP(AUC=0.731)及年龄(AUC=0.616)均可预测脓毒症患者28天死亡情况。结论脓毒症患者lncRNA UCA1水平升高,IncRNA UCA1与多种促炎细胞因子、疾病严重程度和不良预后相关。

基于CRISPR/Cas9技术构建UCA1基因敲除的肺腺癌顺铂耐药株A549/DDP细胞

目的利用CRISPR/Cas9技术构建lncRNA UCA1基因敲除的A549/DDP细胞株。方法设计并合成sgRNA引物序列,退火形成UCA1-sgRNA双链DNA,与线性化pGK1.1载体连接获得重组质粒;电转染至A549/DDP细胞,对pool细胞(混合克隆)测序检测敲除效率,提取pool的靶细胞进行PCR扩增获得杂交DNA;Cruiser^(TM)Enzyme酶切筛选阳性克隆细胞,并对阳性克隆进行测序、TA克隆测序、RT-PCR验证。结果重组质粒测序结果显示,4个UCA1敲除重组质粒在靶位点插入的片段位置、方向及序列与预期结果一致,证明4个UCA1敲除重组质粒均构建成功。克隆细胞酶切结果显示敲除条带明显小于对照条带;测序及TA克隆测序结果与酶切结果一致;RT-PCR显示UCA1表达水平明显低于对照组(P<0.001)。结论成功构建UCA1基因敲除的A549/DDP细胞株,为后续的进一步研究提供了实验基础。

UCA1a(CUDR)基因真核表达载体的构建及其在膀胱癌UM-UC-2细胞中的表达

目的:构建UCA1a(CUDR)基因真核表达载体pcDNA-UCA1a(CUDR),观察其在膀胱癌UM-UC-2细胞中的表达,为研究UCA1a(CUDR)基因与膀胱癌的关系提供实验依据。方法:以膀胱癌BLZ-211细胞的5′-RACE-Ready cDNA为模板,采用PCR法克隆UCA1a(CUDR)全基因,经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,构建pcDNA-UCA1a(CUDR)重组质粒。双酶切及测序鉴定后,稳定转染至体外培养的人膀胱癌UM-UC-2细胞系,利用RT-PCR法检测转染pcDNA-UCA1a(CUDR)的UM-UC-2细胞和转染空质粒pcDNA3.1(+)的UM-UC-2细胞中UCA1a(CUDR)基因的表达。结果:克隆的目的基因片段约为2 200bp,与预期结果相符,表明成功扩增UCA1a(CUDR)基因;经双酶切及测序鉴定,成功构建真核表达载体pcDNA-UCA1a(CUDR)。半定量RT-PCR法检测,与转染空质粒的细胞比较,转染表达载体pcDNA-UCA1a(CUDR)的UM-UC-2细胞中UCA1a(CUDR)基因表达量升高。结论:成功构建pcDNA-UCA1a(CUDR)真核表达载体,且UCA1a(CUDR)基因在转染表达载体的UM-UC-2细胞中高表达。

LncRNA UCA1对肺癌细胞放射敏感性影响及机制研究

目的研究长链非编码RNA(LncRNA)UCA1对肺癌细胞增殖、凋亡及放射敏感性影响及其机制.方法运用qRT-PCR法检测肺癌细胞A549、H1299和人正常肺细胞HBE中UCA1、miR-513a-5p表达.将si-con组(转染si-con)、si-UCA1组(转染si-UCA1)、miR-513a-5p组(转染miR-513a-5pmimics)、miR-NC组(转染miR-NC)、IR+si-con组(转染si-con+照射)、IR+si-UCA1组(转染miR-NC+照射)、IR+miR-513a-5p组(转染miR-513a-5p mimics+照射)、IR+miR-NC组(转染miR-NC+照射)、IR+si-UCA1+anti-miR-513a-5p组(共转染si-UCA1和anti-miR-513a-5p+照射)均用脂质体法转染至A549、H1299细胞,然后部分组进行4Gy照射.MTT法检测各组细胞增殖,克隆形成实验检测细胞增敏比,流式细胞术检测各组细胞凋亡,双荧光素没报告基因检测实验检测各组细胞的荧光活性.结果与HBE细胞相比,A549、H1299细胞中UCA1表达显著升高(P<0.05),miR-513a-5p表达显著降低(P<0.05).抑制UCA1、过表达miR-513a-5p均可明显抑制A549、H1299细胞增殖、促进凋亡、提高放射敏感性(放射增敏比为1.897、2.146和1.615、1.872).miR-513a-5p可抑制野生型UCA1细胞的荧光活性,且UCA1可负向调控miR-513a-5p的表达.抑制miR-513a-5p可逆转抑制UCA1对细胞的放射敏感性的增强作用.结论抑制LncRNA UCA1可增强放射对肺癌细胞敏感性,其机制可能与靶向抑制miR-513a-5p有关.

UCA1-miR-582-EZH2轴对肺癌细胞A549生物学功能的影响机制

目的探究尿路上皮癌相关1基因(UCA1)调控miR-582-5p-Zeste增强子同源物(EZH)2信号轴在非小细胞肺癌(NSCLC)中的调控机制。方法逆转录-聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测UCA1、miR-582-5p和EZH2在NSCLC组织及细胞系(NCI-H460、A549和NCI-H1299)中的表达;Western印迹检测EZH2在NSCLC组织中的蛋白表达;原位杂交(FISH)检测UCA1和miR-582-5p的信号强度;双荧光素酶报告基因检验miR-582-5p抑制剂靶向UCA1和EZH2的调控机制;qRT-PCR检测下调UCA1/miR-582-5p对EZH2 mRNA的调控关系;Transwell、TUNEL细胞凋亡和CCK8分别检测下调UCA1-miR-582-5p-EZH2轴对侵袭、凋亡和增殖的调控能力。结果UCA1和EZH2在NSCLC组织和细胞系中高表达,miR-582-5p则相反为低表达。UCA1竞争性结合miR-582-5p,且miR-582-5p抑制剂可以回补siUCA1负调控EZH2。siUCA1-In-miR-582-5p-siEZH2轴能抑制A549细胞增殖、侵袭及促进凋亡。结论干扰UCA1-miR-582-5p-EZH2轴可能抵抗NSCLC的发生发展。