基于miRNA21-5p调控TGF-β1/Smads信号通路探讨苓桂气化方抗射血分数保留心力衰竭心肌纤维化的机制

目的基于miRNA21-5p调控转化生长因子-β1(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)/Smads信号通路探讨苓桂气化方抗射血分数保留心力衰竭(heart failure with preserved ejection fraction,HFpEF)心肌纤维化的机制。方法40只4周龄自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)平均分为HFpEF组、沙库巴曲缬沙坦组(LCZ696,0.018 g·kg^(-1))、苓桂气化方低剂量组(LGQH-L,3.87 g·kg^(-1))和苓桂气化方高剂量组(LGQH-H,7.74 g·kg^(-1)),给予高脂、高盐及高糖饮食16周及腹腔注射链脲霉素溶液8周建立HFpEF大鼠模型。10只威斯塔京都(Wistar Kyoto,WKY)大鼠和10只SHR大鼠作为对照组,以普通饲料喂养至实验结束。造模成功后,WKY、SHR和HFpEF组给予等剂量生理盐水,其他3组按照预先规定的干预措施,每天灌胃1次,持续6周。干预结束后,行超声心动图测量左心室(left ventricle,LV)前壁厚度(LV end-diastolic anterior wall thickness,LVAWd)、LV后壁厚度(LV end-diastolic posterior wall thickness,LVPWd)、LV舒张末内径(LV end-diastolic internal diameter,LVIDd)、LV射血分数(LV ejection fraction,LVEF)、LV舒张早期二尖瓣流入峰值速度(E)、舒张晚期二尖瓣流入峰值速度(A)和LV舒张早期二尖瓣环运动速度(e'),并计算E/A和E/e';酶联免疫吸附试验检测血清心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)、B型利钠肽(B-type brain natriuretic peptide,BNP)及半乳糖凝集素3(Galectin-3,Gal-3);病理切片进行苏木精伊红及马松染色观察心肌肥厚及纤维化,并计算LV室壁厚度(LV wall thickness,LVWT)、胶原体积分数(collagen volume fraction,CVF)及血管周围纤维化比率(perivascular fibrosis ratio,PFR);实时定量聚合酶链反应检测LV心肌miRNA21-5p及TGF-β1/Smads信号通路相关mRNA表达;蛋白印迹检测LV心肌TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白表达。结果与对照组比较,HFpEF组的LVAWd、LVPWd、LVIDd、E/A、E/e'、ANP、BNP、Gal-3、LVWT、CVF和PFR显著升高(P<0.05或P<0.01);LV心肌miR-NA21-5,α-SMA、CollⅠ、CollⅢ、TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达和α-SMA、CollⅠ、CollⅢ、TGF-β1、P-Smad2/3蛋白表达显著上调(P<0.05或P<0.01);Smad7 mRNA及蛋白表达显著下调(P<0.05或P<0.01)。与HFpEF组比较,苓桂气化方呈剂量依赖性减少LVAWd、LVPWd、LVIDd、E/A、E/e'、ANP、BNP、Gal-3、LVWT、CVF和PFR(P<0.05或P<0.01);下调miRNA21-5p,α-SMA、CollⅠ、CollⅢ、TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达和α-SMA、CollⅠ、GF-β1、P-Smad2/3蛋白表达(P<0.05或P<0.01);上调Smad7 mRNA及蛋白表达(P<0.05或P<0.01)。结论苓桂气化方可能通过靶向miRNA21-5p调控TGF-β1/Smads信号通路抑制心肌纤维化,从而减轻HFpEF大鼠LV重塑和舒张功能障碍,是治疗HFpEF的有效中药复方。

FAM 19A 4、PAX 1及miRNA124-2基因启动子区甲基化在宫颈病变早期诊断中的价值

背景与目的:目前有关宫颈病变的DNA甲基化研究较多,但DNA甲基化作为宫颈病变的诊断及分流指标在临床实践中的报道较少。本研究拟探讨FAM19A4、PAX1及miRNA124-2基因启动子区甲基化在宫颈病变进展中早期诊断的价值。方法:收集2020年3月—2022年3月在郑州大学第三附属医院同时行宫颈液基细胞学(thinprep cytologic test,TCT)和HPV检测的患者的宫颈细胞学标本共129例,采用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)检测不同宫颈病变中FAM19A4、PAX1及miRNA124-2基因启动子区甲基化改变情况,采用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线评估3个基因甲基化改变对宫颈病变的诊断价值。本研究经郑州大学第三附属医院伦理委员会批准(伦理审批编号:2023-135-01)。结果:根据病理学检查结果分为4组:未见上皮内病变或恶性细胞(no intraepithelial lesions or malignant lesions,NILM)组(42例)、低度鳞状上皮内病变(low grade squamous intraepithelial lesion,LSIL)组(28例)、高度鳞状上皮内病变(high grade squamous intraepithelial lesion,HSIL)组(36例)和鳞癌(squamous cervical cancer,SCC)组(23例)。随宫颈病变级别的增加,FAM19A4、PAX1及miRNA124-2基因甲基化检出率逐步增高,差异有统计学意义(P均<0.05)。在HSIL组FAM19A4、PAX1、miRNA124-2甲基化检出率分别为81.2%、80.5%和71.8%,在SCC组3种基因甲基化检出率均高达100.0%;细胞学诊断宫颈癌的ROC曲线下面积(area under curve,AUC)为0.731,诊断灵敏度和特异度分别为65.9%和80.4%;FAM19A4、PAX1及miRNA124-2基因单独诊断HSIL+(HSIL和SCC)时,PAX1甲基化诊断HSIL+的效能最高,AUC为0.925,灵敏度为92.8%,特异度为87.3%;两两联合诊断时,FAM19A4与PAX1联合诊断HSIL+的AUC为0.930,灵敏度为95.7%,特异度为87.1%;FAM19A4与miRNA124-2联合诊断HSIL+,AUC为0.895,灵敏度为97.6%,特异度为85.7%;PAX1联合miRNA124-2诊断HSIL+,AUC为0.928,灵敏度为95.7%,特异度为89.1%;PAX1、FAM19A4及miRNA124-2基因甲基化联合诊断HSIL+,AUC为0.928,灵敏度为100.0%,特异度为81.8%。结论:FAM19A4、PAX1及miRNA124-2基因启动子区甲基化诊断宫颈病变具有较高的灵敏度和特异度,有潜力成为宫颈病变早期诊断的新指标。

血清miRNA21、miRNA155-5P及miRNA20a在早期宫颈癌中的诊断价值

目的 探讨血清微小RNA(miRNA)21、miRNA155-5P及miRNA20a在早期宫颈癌中的诊断价值。方法 选取新疆生产建设兵团第十三师红星医院2019年6月-2023年6月收治的100例早期宫颈癌患者作为观察组,另选同期收治的100例进展期宫颈癌患者为进展期组,100名健康志愿者为对照组。采取荧光定量聚合酶链反应法(qRT-PCR)检测所有受检者血清miRNA21、miRNA155-5P及miRNA20a表达水平,比较血清miRNA21、miRNA155-5P及miRNA20a表达水平与早期宫颈癌临床特征;采用Spearman相关性分析miRNA21、miRNA155-5P及miRNA20a与早期宫颈癌临床特征的相关性,采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清miRNA21、miRNA155-5P及miRNA20a对早期宫颈癌的诊断价值。结果 各组血清miRNA21、miRNA155-5P及miRNA20a相对表达水平及临床分期、病理分级、浸润深度比较,差异有统计学意义(P<0.05);Spearman相关分析结果表明,miRNA21、miRNA20a与早期宫颈癌临床分期、病理分级、浸润深度呈正相关,miR155-5P与早期宫颈癌临床分期呈正相关(P<0.05);ROC曲线结果显示,三者联合、miRNA21、miRNA155-5P、miRNA20a的曲线下面积(AUC)依次为0.897、0.721、0.698、0.641,灵敏度分别为83.54%、73.25%、72.67%、69.57%,特异度分别为81.45%、78.56%、82.54%、72.67%。结论 早期宫颈癌患者血清miRNA21、miRNA155-5P及 miRNA20a表达水平明显升高,且与临床特征密切相关。

加味逍遥散通过外泌体miRNA途径发挥抗肝癌作用

背景:在课题组先前研究中发现加味逍遥散具有明显的抗肝癌作用,但具体作用机制不明。目的:基于高通量测序结合生物信息学,探讨加味逍遥散对二乙基亚硝胺慢性诱导的原发性肝癌模型大鼠血浆外泌体miRNA水平的调节作用。方法:将SD大鼠随机分为空白对照组、肝癌模型组、加味逍遥散组。以二乙基亚硝胺持续给药12周诱导肝癌模型,从第17周开始,加味逍遥散组大鼠给予加味逍遥散灌服,每日1次,直至第20周末停药,空白对照组和肝癌模型组大鼠给予等量生理盐水灌胃,通过检测大鼠肝组织的形态结构、肝癌标志物Glypican-3蛋白和血清甲胎蛋白表达验证抗肝癌效应。使用超速离心法分离提取各组大鼠血浆外泌体,利用高通量测序技术筛选出大鼠血浆外泌体中差异表达的miRNA,生物信息学预测加味逍遥散通过肝癌血浆来源外泌体miRNA发挥抗肝癌作用的潜在生物标志物,并进行功能分析。结果与结论:①加味逍遥散对肝癌模型大鼠肝组织的形态结构有显著改善作用,与肝癌模型组相比,加味逍遥散组肝癌标志物Glypican-3蛋白和血清甲胎蛋白的表达均显著降低;②生物信息学分析显示,加味逍遥散组对肝癌模型组上调的miR-223-3p与基因E2F1、NCOA1存在靶向结合位点,并且与肝癌生存率及预后密切相关。由此可见,加味逍遥散对肝癌有治疗作用,可能是通过肝癌血浆来源外泌体miR-223-3p靶向负调控NCOA1/E2F1进而发挥抗肝癌效应。

血清miRNA-21、术前清蛋白-球蛋白比值对大脑胶质瘤预后的预测价值

目的:探讨血清miRNA-21、术前清蛋白-球蛋白比值与胶质瘤预后的关系。方法:选取2019年1月—2023年1月243例术后病理检查确诊为胶质瘤的病人,收集病人年龄、性别、吸烟和饮酒情况、体质指数、Karnofsky表现状态(KPS)、肿瘤大小、肿瘤位置(脑区)、切除范围、术前淋巴细胞计数、术前清蛋白水平、辅助放疗、化疗等资料,并根据磁共振成像数据计算肿瘤大小,采集病人术前1周血液学指标数据,评估术前清蛋白与球蛋白比值(AGR)及总生存期(OS)。检测血清miRNA-21,OS由Kaplan-Meier分析估计,采用受试者工作特征(ROC)曲线分析AGR和miRNA21的预测能力。Cox比例风险模型用于单变量和多变量分析。结果:排除65例不符合纳入标准的病人和12例失访病人,共纳入166例病人。Kaplan-Meier分析曲线显示,AGR≤1.75或miRNA-21≤48的病人OS明显低于AGR>1.75或miRNA-21>48的病人(P均<0.001)。1年生存期:AGR和miRNA-21的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.680,0.631;2年生存期:AGR和miRNA-21的AUC分别为0.651,0.656。在多变量分析中,AGR[HR=0.785,95%CI(0.357,0.979),P=0.040]和miRNA-21[HR=0.757,95%CI(0.378,0.985),P=0.039]均是OS的独立预测因子。结论:术前AGR和miRNA-21与胶质瘤病人的OS显著相关。基于术前炎症、免疫和营养状况等指标,AGR和miRNA-21可为胶质瘤病人制定更有效的术前调节策略和更好的辅助治疗方案。

6-姜烯酚通过miRNA-26a-5p/DAPK1减轻大鼠脑缺血再灌注损伤

为探究6-姜烯酚(6-Shogaol,6-SH)对大鼠脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI)的保护作用,采用分子对接观察6-SH能否自发性结合microRNA-26a-5p(miRNA-26a-5P),双萤光素报告基因检测验证miRNA-26a-5p与死亡相关蛋白激酶1(ceath associated protein kinase 1,DAPK 1)的靶向关系;线栓法制备大鼠CIRI模型,雄性SD大鼠随机为假手术组、模型组、6-姜烯酚组;于CIRI后72 h进行改良神经功能评分,氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色,评分后采集脑组织标本进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)染色观察神经细胞病理损伤情况,透射电镜观察神经元超微结构及自噬情况,免疫荧光检测自噬标志物,实时荧光定量和蛋白印迹法检测自噬和钙超载相关蛋白和基因。实验结果表明6姜烯酚可上调miRNA-26a-5p的表达,抑制DAPK1的表达,减轻大鼠CIRI后过度自噬和钙超载,发挥神经保护作用。

miRNA 452-5P及miRNA 215-5P在结直肠癌中的表达及意义

目的研究miRNA 452-5P及miRNA 215-5P在结直肠癌中的表达及其与临床病理特征的关系,并分析其诊断价值。方法收集30组结直肠癌患者的结直肠癌组织及癌旁正常肠黏膜组织,采用实时荧光定量PCR技术检测全部患者结直肠癌组织及癌旁正常肠黏膜组织中miRNA 452-5p、miRNA 215-5p的表达,分析其与临床病理资料之间的关系,并进行ROC分析。结果 miRNA 452-5P在结肠癌组织中表达显著下调(P<0.001),miRNA 215-5p在结肠癌组织中表达显著上调(P<0.001),两种miRNA与结直肠癌患者年龄、性别、分化程度、肿瘤位置、浸润深度、淋巴转移、Dukes分期等均不相关。miRNA 452-5p曲线下面积AUC=0.859(95%CI:0.719～0.999),miRNA 215-5p曲线下面积为AUC=0.879(95%CI:0.757～1.0)。2-miRNAs panel曲线下面积为AUC=0.930(95%CI:0.833～1.0)。结论 miRNA 452-5p在结肠癌组织中表达显著下调,miRNA 215-5p在结直肠癌组织中表达显著上调。2-miRNAs panel对结直肠癌诊断价值较高,可作为潜在的结直肠癌诊断价值的分子标志物和治疗靶点。

miRNA-31靶向基质金属蛋白酶-3基因对宫颈鳞癌侵袭力的影响

目的探讨miRNA(miR)-31对宫颈鳞癌siHa细胞系侵袭性的影响及其可能存在的作用靶点。方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及Western印迹对比宫颈鳞癌组织、正常宫颈组织及siHa细胞系中miR-31、基质金属蛋白酶(MMP)-3mRNA及蛋白表达情况。通过mimics上调siHa细胞miR-31表达后,运用transwell小室研究siHa细胞袭性变化。结果宫颈鳞癌组织较正常宫颈组织miR-31表达明显下调,差异达14.64倍(P<0.01)。上调siHa细胞miR-31表达后,MMP-3蛋白表达显著降低(P<0.05),siHa细胞侵袭能力明显下降(P<0.05)。结论 miR-31在宫颈鳞癌细胞表达下降,miR-31能抑制siH a癌细胞侵袭的能力,而MMP-3是miR-31下游作用靶点。

通过测序与预测分析靶向奶牛乳腺κ-酪蛋白的miRNA

本研究旨在验证通过测序与预测分析靶向奶牛乳腺κ-酪蛋白(CSN3)的miRNA。应用乳腺组织的小RNA测序、TargetScan预测和RNAhybrid分析,筛选了4个可能靶向CSN3的miRNA,分别是bta-miR-33a、bta-miR-2284ab、bta-miR-193b和bta-miR-193a-3p。接着,通过荧光素酶报告试验检测CSN3-3’非编码区(3’ UTR)和4种miRNA的结合情况,结果表明只有bta-miR-193b和bta-miR-193a-3p能与CSN3-3’UTR结合(P<0.01)。牛奶体细胞相关基因表达趋势进一步验证了bta-miR-193b和bta-miR-193a-3p与CSN3的靶向关系。这些结果提示,bta-miR-193b和bta-miR-193a-3p可直接靶向CSN3,这可以解释从泌乳高峰期至泌乳后期牛奶中CSN3蛋白总量的减少。本试验结果为乳蛋白的调控研究提供了依据,并为miRNA的功能研究铺垫了道路。

TGF-β1诱导乳腺癌细胞上皮-间充质转化中相关miRNAs筛选

目的:探讨转化生长因子β1(TGF-β1)诱导乳腺癌细胞MCF-7上皮-间充质转化(epithelialmesenchymal transition,EMT)的最佳浓度以及miRNAs在其中的差异表达。方法:不同浓度的TGF-β1作用于MCF-7细胞48h,光学显微镜下观察MCF-7细胞形态学的变化,同时Real-time PCR检测MCF-7细胞中上皮和间充质标志物表达变化;进一步利用Real-time PCR对通过生物信息学挑选的差异表达的miRNAs进行验证。结果:10ng/ml的TGF-β1作用MCF-7细胞48h后,能诱导MCF-7细胞发生EMT转化,同时筛选出与EMT密切相关的4个miRNAs(miR-16,miR-196a,miR-196b和miR-21)。结论:miR-16、miR-196a、miR-196b和miR-21在TGF-β1诱导的EMT细胞模型中表达上调,发现这4个miRNAs与TGF-β1诱导的EMT密切相关。

miRNA-497与miRNA-195基因簇在宫颈癌组织中的表达及预测靶基因的生物信息学分析

目的探讨miRNA-497-195基因簇在宫颈癌组织中的表达,并对其预测的靶基因进行生物信息学分析,为miRNA-497-195基因簇在宫颈癌发生中的作用机制研究提供理论基础。方法收集2010年3月～2012年3月在广西壮族自治区人民医院就诊患者的宫颈标本,利用miRNA芯片技术检测宫颈病变组织中miRNA表达谱,用real-time RT-PCR进行验证;采用real-time RT-PCR检测miRNA-497和miRNA-195在宫颈病变组织中的表达情况,并用Spearman法进行miRNA-497与miRNA-195相关性分析。通过生物信息学预测miRNA-497和miRNA-195的靶基因,并对其靶基因进行GO（gene ontology）功能富集分析及信号转导通路富集分析。结果芯片结果显示,宫颈癌及高度鳞状上皮内瘤变中miRNA-195和miRNA-497表现为下调（均P〈0.05）。real-time RT-PCR结果显示,miRNA-497和miRNA-195在宫颈癌组织中表现为下调,且表达存在显著性相关（r=0.983,P〈0.05）。miRNA-497和miRNA-195预测靶基因大量重合,且集合功能也大量重合,并富集于细胞周期调控、生物学过程调控、转录调控、基因表达及核苷酸代谢过程等生物学过程,以及蛋白结合、核酸结合、蛋白激酶活性、连接酶活性等分子功能（P〈0.01）;KEGG通路分析涉及癌症通路、p53信号通路、GnRH信号通路、细胞外因子信号通路等信号传导通路及直肠癌、前列腺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、慢性粒细胞性白血病、非小细胞肺癌等疾病通路（P〈0.05）。结论 miRNA-195和miRNA-497在宫颈癌组织中呈现低表达,二者表达呈显著正相关,miRNA-497-195基因簇可能是宫颈癌的抑制因子。miRNA-497和miRNA-195预测靶基因功能大量重合,并显著富集在与肿瘤发生相关的信号通路中。

沉默miRNA210可能通过低氧诱导因子-血管内皮生长因子途径减轻心肌炎时心肌细胞的损伤

目的研究miRNA210在脂多糖(LPS)诱导心肌炎时对大鼠原代心肌细胞的作用及其内在机制。方法采用CCK8法检测正常或LPS诱导时miRNA210对大鼠原代心肌细胞活力的影响;ELISA法检测在LPS诱导前提下,miRNA210处理后肿瘤坏死因子(TNF)-α与白细胞介素(IL)-1β的分泌情况;流式细胞凋亡法检测各干预组前后大鼠原代心肌细胞的凋亡情况;Western blot法检测凋亡相关蛋白bcl-2、bax、caspase-3和低氧诱导因子1(HIF1)-血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况。结果CCK8检测结果显示,与对照组相比,miRNA210模拟物(t=0.000,P=1.000)和siRNA(t=0.686,P=0.500)干扰对大鼠原代心肌细胞的影响差异无统计学意义,LPS处理后大鼠原代心肌细胞的细胞活力明显降低(t=8.764,P<0.001);与LPS组相比,抑制miRNA210后大鼠原代心肌细胞活力明显升高(t=3.576,P=0.012)。ELISA检测结果显示,与对照组相比,LPS诱导后IL-1β(t=4.166,P=0.014)和TNF-α(t=6.309,P=0.003)表达显著上调;与LPS组相比,应用miRNA210模拟物后IL-1β(t=4.096,P=0.015)和TNF-α(t=4.424,P=0.011)表达显著升高,沉默miRNA210后IL-1β(t=4.287,P=0.012)和TNF-α(t=3.577,P=0.023)表达显著下调。流式细胞凋亡实验结果表明,与对照组相比,LPS诱导后的大鼠原代心肌细胞凋亡明显增加(t=32.780,P<0.001);与LPS组相比,应用miRNA210模拟物明显加重了LPS诱导的细胞凋亡(t=7.412,P=0.002),沉默miRNA210后的大鼠原代心肌细胞凋亡率明显降低(t=11.720,P<0.001)。Western blot检测结果表明,与对照组相比,LPS显著下调了bcl-2表达(t=8.346,P=0.001),上调了bax(t=12.890,P<0.001)和caspase-3的表达(t=4.331,P=0.012)。与LPS组相比,应用miRNA210模拟物后bcl-2(t=6.074,P=0.003)表达明显下降,bax(t=5.376,P=0.022)和caspase-3(t=5.859,P=0.004)表达明显升高;沉默miRNA210后bcl-2表达明显升高(t=3.873,P=0.017),bax(t=5.205,P=0.006)和caspase-3(t=2.800,P=0.040)表达明显下降。与对照组比,LPS组的HIF1(t=10.380,P=0.001)和VEGF(t=4.973,P=0.008)表达显著上调;与LPS组相比,应用miRNA210模拟物后的HIF1(t=8.952,P=0.001)和VEGF表达(t=11.203,P=0.001)显著上调,沉默miRNA210后的HIF1(t=3.893,P=0.017)和VEGF表达(t=3.181,P=0.033)显著降低。与LPS组相比,应用2ME后逆转miRNA210模拟物后的bax(t=4.899,P=0.008)、HIF1(t=2.833,P=0.047)及caspase-3(t=2.877,P=0.045)和VEGF表达(t=2.994,P=0.040)显著降低,bcl-2表达(t=3.392,P=0.017)显著升高。结论沉默miRNA210可通过HIF1-VEGF介导的凋亡通路来减少LPS诱导的心肌细胞损伤。

粪便miRNA675-5p联合qFIT检测对结直肠癌筛查的诊断价值

目的探讨粪便miRNA675-5p联合qFIT在结直肠癌筛查中的诊断价值。方法纳入2016年1月至2021年12月于武汉科技大学附属天佑医院和十堰市太和医院就诊的173例患者,收集其临床资料及粪便标本,包括48例结直肠癌组、46例腺瘤组、42例息肉组、37例正常对照组。采用qRT-PCR法检测粪便miRNA675-5p,定量粪便免疫化学检测(qFIT)检测粪便潜血。采用ROC曲线评估qFIT及miRNA675-5p联合qFIT检测对结直肠癌及腺瘤的诊断价值。结果结直肠癌组的qFIT值[259.94(36.25,758.55)]明显高于腺瘤组[0(0,13.42)]、息肉组[0(0,0)]、正常对照组[0(0,0)],差异有统计学意义(均P<0.01);腺瘤组高于息肉组和正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结直肠癌组qFIT敏感度为85.4%,特异度为100%;腺瘤组qFIT敏感度为28.3%,特异度为97.3%。联合检测(miRNA675-5p联合qFIT)结直肠癌组敏感度100%,特异度89.2%;腺瘤组敏感度71.7%,特异度86.5%。结直肠癌组、腺瘤组联合检测优于qFIT单独检测,差异有统计学意义(均P<0.01)。结论miRNA675-5p联合qFIT检测能够提高早期结直肠癌筛查诊断效能。

miRNAs联合CA19-9对胰腺癌的诊断效能

目的研究血清miRNAs(miR-16)联合CA19-9对胰腺癌的诊断效能。方法收集45例慢性胰腺炎患者、45例胰腺癌患者和30例健康人作对照,采用实时逆转录-多聚酶链反应方法检测血浆miR-16表达水平和临床检测糖链抗原19-9(CA19-9),分析miR-16、CA19-9及其二者联合对胰腺癌的诊断效能。结果 miR-16在血浆中含量胰腺癌>慢性胰腺炎(P<0.05),慢性胰腺炎组与健康对照组差异无统计学意义;miR-16联合CA19-9与miR-16、CA19-9单独诊断比较,miR-16与CA19-9联合可显著提高诊断胰腺癌的敏感性和特异性,LR+均>20,LR-均<0.2。结论 miR-16联合CA19-9可提高胰腺癌的诊断效能。

MT1-MMP miRNA干扰载体的构建及沉默效果评价

目的:构建膜型基质金属蛋白酶-1(membrane-type matrix metalloproteinase-1,MT1-MMP)基因miRNA干扰载体,检测其对靶基因的沉默效率。方法:设计4种MT1-MMP基因特异性miRNA寡聚单链DNA,利用载体构建试剂盒构建MT1-MMP基因特异性干扰质粒,挑选阳性克隆,测序无误后扩增,表明载体构建成功。抽提干扰质粒,用脂质体2000转染HEK293细胞,通过实时荧光定量PCR法检测干扰载体对靶基因的干扰效果。结果:本实验成功构建了MT1-MMPmiRNA干扰载体,筛选出最有效的干扰载体X173-4,并检测出其对靶基因的沉默效率可达到75%。结论:本实验结果为进一步研究MT1-MMP在口腔癌侵袭转移机制中的作用提供实验基础。

急性缺血性脑卒中患者血清miRNA-181c-5p,miRNA-340-5p和miRNA146a水平表达检测的诊断价值研究

目的探究急性缺血性脑卒中(acute ischemic stroke,AIS)患者血清miRNA-181c-5p,miRNA-340-5p和miRNA146a水平表达检测的诊断价值。方法选取西安医学院第一附属医院急诊科2019年5月~2020年3月收治的65例AIS患者为病例组,另选同期50例体检健康者为对照组。比较两组的糖尿病史、高血压史和高血脂史,采用实时灾光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测miRNA-181c-5p,miRNA-340-5p和miRNA146a的水平。采用美国国立卫生院卒中量表(NIH stroke scale,NIHSS)评估AIS患者的神经功能缺损程度。采用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic,ROC)计算miRNA-181c-5p,miRNA-340-5p和miRNA146a的AIS诊断价值。结果两组的糖尿病史、高血压史和高血脂史比较差异无统计学意义(P>0.05)。相比于对照组,病例组血清中miRNA-181c-5p,miRNA-340-5p和miRNA146a水平均升高,其差异具有统计学意义(t=20.700,25.997,23.629,均P=0.000)。Pearson相关性分析结果显示,血清中miRNA-181c-5p,miRNA-340-5p和miRNA146a水平与NIHSS评分均呈显著正相关,其差异具有统计学意义(r=0.272,P<0.001;r=0.142,P=0.005;r=0.171,P=0.013)。miRNA-181c-5p,miRNA-340-5p和miRNA146a联合检测诊断AIS的灵敏度和特异度分别为71.2%和76.4%,高于三项单独和两两联合检测。结论miRNA-181c-5p,miRNA-340-5p和miRNA146a三者联合检测可进一步提高AIS患者的诊断率,为临床应用提供了可靠的理论基础。

乏情和发情初产母猪下丘脑-垂体轴中miRNA表达谱比较分析

【目的】从神经内分泌系统揭示微小RNA(microRNA,miRNA)调控初产母猪情期活动的遗传机制。【方法】利用RNA-Seq技术对乏情和发情初产母猪下丘脑-垂体轴中的small RNA进行测序,获得了母猪下丘脑和垂体miRNA表达谱,并对筛选的差异表达miRNA进行GO和KEGG等功能分析。【结果】从所构建的4个文库中共鉴定出1096个miRNAs,其中已知miRNAs 364个,新预测miRNAs 732个。以发情母猪为对照,在乏情母猪的下丘脑有16个miRNAs存在差异表达,其中6个上调,10个下调;在乏情母猪垂体有9个miRNAs存在差异表达,其中2个上调,7个下调。下丘脑中16个差异表达miRNAs共预测到5212个靶基因,垂体中9个差异表达miRNAs共预测到6897个靶基因。下丘脑中靶基因主要在细胞投射组装、质膜结合的细胞投射组装、神经元投射发育的负调控、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性等GO条目及Ras信号通路、神经营养因子信号通路、ErbB信号通路、mTOR信号通路等KEGG信号通路中显著富集;垂体中靶基因主要在mRNA加工调控、Ras GTP酶结合、泛素样蛋白连接结酶活性、表皮生长因子受体结合等GO条目及蛋白激酶、鞘脂类信号通路、凋亡、ErbB信号通路、NF-κB信号通路等KEGG信号通路中显著富集。从构建的差异表达miRNAs与生殖相关功能靶基因的调控网络中,筛选的Chr3_8404_mature、ssc-miR-9和ssc-miR-34c可能在下丘脑-垂体轴中对初产母猪情期活动的调控起重要作用。下丘脑和垂体各选4个差异表达miRNAs进行实时荧光定量PCR验证,其表达趋势与测序结果基本一致。【结论】本研究成功构建了乏情和发情初产母猪下丘脑-垂体轴miRNA的表达谱,并对差异表达miRNA的功能进行了深度挖掘,筛选到了3个对初产母猪情期活动起重要作用的miRNAs,为初产母猪情期活动遗传机制的解析提供了miRNAs方面的理论依据。

miRNA“海绵”重组质粒的构建及对miR-483-5p的敲减

目的建立microRNA失功能(loss of function)研究模型,为功能研究提供实验材料。方法针对miR-483-5p成熟体序列设计含6个拷贝反义序列的DNA片段,称为"S-483",将其连接入含CAG启动子的pCAGGs载体中,构建pCAGGs-S-483重组质粒。利用脂质体技术瞬时转染Hep1-6细胞,经re-al-time PCR对成熟miR-483-5p含量进行检测。结果转染pCAGGs-S-483组miRNA-483含量(0.33±0.04)较转染空质粒组(1.00)明显下降(P<0.01),但对其它miRNAs无影响。结论 S-483海绵策略可有效"吸附"并降低miR-483-5p,成功构建了pCAGGs-S-483重组质粒,为其功能研究和miRNA敲减动物的建立提供了有益借鉴。

miRNA152-3p在前列腺癌的变化及其意义

目的:观察miRNA152-3p在前列腺癌患者血清中的水平变化,并探讨其意义。方法:选择前列腺癌患者30例(PCa组)、前列腺增生患者30例(BPH组)。采取各组血清,采用实时荧光定量免疫技术检测血清水平,分析水平与前列腺癌临床病理特征的关系。结果:miRna-152-3p在血清中高表达与患者年龄无统计学意义(P> 0. 05),与临床分级、Gleason评分、有无骨转移、血清t PSA水平(P <0. 01)具有统计学意义。结论:miRna-152-3p与前列腺癌组织的浸润、转移及预后有关,可作为疾病诊断、预后因子及相关靶向药物抑制转移因子。

针刺对CIRI大鼠缺血侧海马区miRNA表达及miR-20a-5p和miR-22-5p的影响

目的观察针刺对脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)大鼠缺血侧海马区miRNA表达及miR-20a-5p和miR-22-5p的影响,以探究针刺修复CIRI的可能机制。方法60只大鼠采用随机数字表法分成正常组、假手术组(Sham组)、CIRI组及CIRI+针刺组,每组15只。CIRI组及CIRI+针刺组参照优化版Zea Longa线栓法复制大脑中动脉缺血再灌注模型;Sham组只插入线栓不阻断中动脉。Sham组及CIRI组造模后不予针刺,CIRI+针刺组造模后于人中、百会、大椎穴予针刺干预,正常组不予任何处理。分别于治疗前后行神经功能症状缺损评分观察大鼠神经症状变化;治疗后,采用TTC染色检测脑梗死面积比;基因芯片技术检测CIRI大鼠缺血侧海马区miRNA表达;qPCR检测CIRI大鼠缺血侧miR-20a-5p、miR-22-5p的表达量。结果(1)与治疗前比较,治疗后CIRI+针刺组的神经功能症状缺损评分显著下降(P<0.01),其余各组差异均无统计学意义(P>0.05)。治疗后,与正常组及Sham组比较,CIRI组及CIRI+针刺组神经功能症状缺损评分及脑梗死面积比均显著升高(P<0.01);与CIRI组比较,CIRI+针刺组神经功能症状缺损评分及脑梗死面积比明显下降(P<0.05)。(2)基因芯片检测结果示,与正常组比较,CIRI组差异表达4个miRNA,且其中2个参与调控细胞增殖、3个参与调控细胞凋亡;与Sham组比较,CIRI组差异表达5个miRNA,且其中3个参与调控细胞增殖、1个参与调控细胞凋亡;与CIRI组比较,CIRI+针刺组差异表达16个miRNA,且其中12个参与调控细胞增殖、10个参与调控细胞凋亡。CIRI+针刺组与CIRI组改变了相同功用的miRNA,其中包括miR-20a-5p和miR-22-5p。(3)qPCR结果示,与正常组比较,CIRI组miR-20a-5p表达增加(P<0.01)、miR-22-5p表达降低(P<0.01);与Sham组比较,CIRI组miR-20a-5p表达增加(P<0.01)、miR-22-5p表达降低(P<0.05);与CIRI组比较,CIRI+针刺组miR-20a-5p表达降低(P<0.01)、miR-22-5p表达增加(P<0.05)。结论针刺能明显改善CIRI大鼠神经功能症状缺损评分及脑梗死面积比,促进脑缺血再灌注后修复,其机制可能与激发多种类、多功能miRNA的改变,特别是与下调miR-20a-5p、上调miR-22-5p的表达量,促进细胞增殖、抑制细胞凋亡功能相关。