sFv-TNF-α基因修饰的PBMCs对人肝癌细胞系HHCC的体外杀伤活性研究

目的 观察分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因 (sFv TNF α)的重组逆转录病毒转导的PBMCs对体外培养人肝癌细胞 (HHCC)的杀伤作用。方法 用感染性重组病毒产生细胞C2 2 (PA3 17 PST)产生的病毒上清转导人PBMCs ,采用PCR、RT PCR方法对转导的PBMCs进行DNA和mRNA水平的分析。转导的PBMCs(PBMCs PST)与HHCC共培养 ,MTT法检测PBMCs PST表达产物对肝癌细胞的体外杀伤活性。结果 PCR、RT PCR结果显示PBMCs PST中扩增出外源目的基因对应的电泳条带。MTT法检测结果 ,分泌型抗肝癌单链双功能抗体对体外培养肝癌细胞HHCC的杀伤率为 ( 3 1.4± 4.1) %。结论 分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因可以在PBMCs中整合并稳定表达 ,其分泌的表达产物对HHCC具有一定的体外杀伤作用。

PG肿瘤分泌物对PBMC活性及细胞因子分泌的影响

目的应用PG肿瘤细胞分泌的上清液培养正常外周血单个核细胞(PBMC),探讨PG肿瘤细胞分泌物对正常PBMC的活性及分泌细胞因子的影响,以进一步揭示肿瘤的免疫逃逸机制。方法将不同浓度的肿瘤细胞培养上清液与体外分离的PBMC一起培养,用MTT法检测细胞代谢活性,流式细胞术检测细胞内细胞因子分泌的变化情况。结果 PG培养上清能够提高PBMC活性,并使Th1、Th2类细胞因子表达增加。结论肿瘤上清确实能使PBMC活化,同时激活PBMC细胞分泌细胞因子。

人肺癌PG细胞培养上清液对PBMC凋亡的影响

目的:探讨PG肿瘤上清对外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的增殖抑制及诱导凋亡方面的影响,并探讨了PG细胞影响PBMC凋亡的作用机制。方法:在PBMC培养体系中分别加入不同条件的PG培养上清。在24、72小时收集PBMC,采用流式细胞术测定其对PBMC细胞周期、凋亡率的影响,另外,通过免疫印迹法、流式细胞术分别测定了Bcl-2、Fas蛋白表达的情况来观察PBMC凋亡相关蛋白的变化。结果:PG肿瘤上清没有抑制PBMC进入细胞周期,在PG上清的作用下,PBMC凋亡率显著增加,并且发现PG上清能够调节PBMC内凋亡相关蛋白Bcl-2、Fas的表达量。结论:PG上清能够调节PBMC凋亡相关蛋白量,进而诱导PBMC凋亡,这可能是导致肿瘤微环境中PBMC数量低下的主要原因。

脐带间充质干细胞改善自身免疫性肝炎免疫微环境的机制

目的探讨脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs)对自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)免疫微环境的影响及潜在的调控机制。方法将AIH患者外周血单个核细胞(PBMCs)与UCMSCs分别以10∶1(Co⁃culture 1)或5∶1(Co⁃culture 2)的比例共培养。流式细胞术检测Th17、Treg及Th17/Treg比值;ELISA检测上清中转化生长因子β1(TGF⁃β1)、白细胞介素⁃17(IL⁃17)和IL⁃6的水平。运用RNA⁃seq筛选PBMCs共培养前后的差异基因,富集前15个表达量最高的mRNA进行后续生物信息分析。Western blot和RT⁃qPCR测定Foxp3、RORγt表达水平。结果UCMSCs显著降低CD3^(+)CD8^(-)IL⁃17A^(+)Th17比例,增加CD25^(+)Foxp3^(+)CD4^(+)Treg比例。与PBMCs组相比,Co⁃culture 2组的TGF⁃β1显著上调(P<0.01),IL⁃17和IL⁃6显著下调(P<0.05)。转录组测序分析发现转录因子主要集中在免疫应答及T细胞激活等领域;其中SMAD3和STAT3占据较核心的地位。蛋白和mRNA检测显示,Co⁃culture 2组Foxp3和SMAD3的表达水平显著上调(P<0.05),RORγt和STAT3的表达水平显著下调(P<0.05)。结论UCMSCs通过TGF⁃β通路促进Th17向Treg细胞分化,抑制炎症反应改善肝脏免疫微环境。

IFN－γ和IL－4对IgE生成的调节作用探讨

本文通过对鸡蛋过敏患者血清及外周血单个核细胞（ＰＢＭＣｓ）培养上清的ＩｇＥ水平测定，探讨了γ－干扰素（ＩＦＮ－γ）、白细胞介素４（ＩＬ－４）参与ＩｇＥ生成的调节机制。结果表明：ＩＦＮ－γ可抑制ＩｇＥ的生成，而ＩＬ－４则相反。ＰＢＭＣｓ培养上清中ＩＦＮ－γ和ＩＬ－４与ＩｇＥ浓度之间呈显著相关。

与脐带间充质干细胞共培养促进奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成及其机制

目的研究脐带间充质干细胞(UCMSC)调节奶牛乳腺上皮细胞(BMEC)乳蛋白合成的可能作用机制。方法利用TranswellTM小室将UCMSC和BMEC进行双层共培养,BMEC单纯培养为对照组,胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)抑制剂AG1024处理细胞,ELISA检测上清IGF-1和β酪蛋白(CSN2)、κ酪蛋白(CSN3)含量变化,实时定量PCR检测Janus激酶2/信号转导子与转录激活子5(JAK2/STAT5)信号通路相关基因的相对表达丰度;再用JAK2信号通路阻断剂AG490孵育细胞,实时定量PCR检测CSN2、CSN3 mRNA的相对表达丰度。结果与UCMSC共培养后,BMEC的CSN2、CSN3合成量和CSN2、CSN3、JAK2、STAT5、E74样ETS转录因子5(ELF5)mRNA相对表达丰度均显著高于单纯培养的BMEC;AG1024处理后,显著降低BMEC的CSN2、CSN3合成量,显著降低CSN2、CSN3、JAK2、STAT5、ELF5 mRNA的相对表达丰度;给予AG490阻断后,显著降低CSN2、CSN3 mRNA相对表达丰度;在AG1024基础上,加入AG490后显著降低CSN2、CSN3 mRNA相对表达丰度。结论UCMSC能够通过IGF-1介导JAK2/STAT5信号通路,上调BMEC乳蛋白合成关键基因mRNA的表达丰度,促进其乳蛋白的合成。

人胎胸腺素对T细胞增殖及IL－2分泌的影响

胸腺素具有广泛的免疫调节作用。本文观察了人胎胸腺素（ＨＦＴ）在体外对人周围血Ｔ细胞的增殖及对周围血单个核细胞（ＰＢＭＣ）分泌ＩＬ－２的影响，实验结果表明：ＨＦＴ能刺激Ｔ细胞增殖，１％ＨＦＴ的作用最强，但未见ＨＦＴ与ＰＨＡ对Ｔ细胞增殖的协同促进作用；而ＨＦＴ对ＰＢＭＣ分泌ＩＬ－２的影响不明显，ＨＦＴ与ＰＨＡ共同作用的效应约有提高，亦仅相当于ＩＬ－２在１．９～７．８ｕ／ｍｌ时的效应。

不同浓度芦荟多糖对外周血单个核细胞和HepG2生长的影响

目的:为芦荟多糖的抗肿瘤作用研究提供实验用细胞模型,筛选最佳干预药物及其浓度。方法:采用人淋巴细胞分离液,Ficoll Hypaque密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC),AlamarBlue法观察芦荟多糖对PBMC生长的影响,四唑氮蓝(Methylthiazoletrazolium,MTT)法观察芦荟多糖对HepG2生长的影响。结果:密度梯度离心法成功分离PBMC。芦荟多糖AP11在200μg·mL-1时已较明显促进和维持PBMC的生长(P<0.01),各不同浓度芦荟多糖对HepG2的生长无显著影响(P>0.05)。结论:芦荟多糖AP11(200μg·mL-1)可作为开展抗肿瘤作用机理的理想实验用药。

应用噻唑蓝法初步研究兔外周血单个核细胞转化的条件

应用噻唑蓝法研究了ＰＨＡ－Ｐ引起兔外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）转化的最适条件，培养时间为４８ｈ，ＰＢＭＣ密度为５×１０１２／Ｌ，ＰＨＡ－Ｐ的终浓度为０．５ｍｇ％。并测定了在此最适条件下的吸光值（ＯＤ），为０．２７６±０．１４２。

健康人外周血血清Ig浓度与Ig分泌细胞数的关系

本文测定未培养外用血单核细胞（PBMCs）、B细胞及T细胞中的免疫球蛋白（Ig）分泌细胞，对在某种程度体内产生Ig的能力进行了评价。结果为：B细胞群中的Ig分泌细胞数比PBMCs中的多3－5倍，提示B细胞在体内已接受了T细胞的活化信号，放在体外试验中Ig分泌细胞在T细胞缺如时也能分泌Ig。健康个体PBMCs中Ig分泌细胞数与血清三种Ig的浓度呈平行关系。因此，测定PBMCs中的Ig分泌细胞数有助于确定在某种程度体内的Ig生成能力。

两种淋巴因子对IgE生成的调节作用

本文通过对鸡蛋过敏患者血清及外周血单个核细胞（PBMCs）培养上清的IgE水平测定，探讨了γ—干扰素（IFN－γ）、白细胞介素4（IL－4）参与IgE生成的调节机制。结果表明，IFN－γ可抑制IgE的生成，而IL—4则相反。PBMCs培养上清中IFN－γ和IL—4浓度之间呈显著相关。

鸡脐带间充质干细胞向胰岛β样细胞诱导分化的研究

为了建立鸡脐带间充质干细胞(Umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs)体外培养体系并对其进行生物学特性研究。取11～15日龄鸡胚,脐带分离获得UCMSCs,在L-DMEM培养基中培养,观察其形态。通过传代、生长曲线和周期分析其增殖情况,并研究体外诱导分化潜能。结果表明,鸡UCMSCs可在体外扩增培养,目前传代至P30,表达CD29、CD44和CD71,并具有向胰岛β样细胞诱导分化的潜能。鸡脐带中可以分离出UCMSCs,能够在体外培养,并可诱导分化为胰岛β样细胞。

利用单个核细胞培养扩增NK细胞体系探索

目的:探寻一种通过单个核细胞使自然杀伤(NK)细胞在体外培养扩增的新方法,为NK细胞免疫治疗奠定实验基础。方法:收集3份健康足月孕妇的脐带血,应用密度梯度法分离单个核细胞(PBMNC),每份单个核细胞样本均分为CD16 m Ab、CD3 m Ab和CD16 m Ab+CD3 m Ab处理3组。使用含自体血浆、重组人IL-2、IL-15和IL-21的无血清培养液,在相同条件下培养扩增14 d,计算其扩增倍数。应用流式细胞术测定CD56^+CD3^-比例;以K562细胞为靶细胞,应用MTT法测定所培养的NK细胞在不同效靶比条件下的杀伤率。结果:培养14 d后,CD16m Ab、CD3 m Ab和CD16 m Ab+CD3 m Ab组细胞总数分别扩增45.71±5.54、87.41±19.77和51.84±4.88倍,在CD3 m Ab组显著高于其它2组(P<0.05)。培养前CD56^+CD3^-细胞比例为0.1663±0.0201,经培养扩增14 d后CD16 m Ab、CD3 m Ab和CD16 m Ab+CD3 m Ab组CD56^+CD3^-细胞比例分别为0.8167±0.0500、0.8077±0.0589和0.8077±0.0273,3组之间无显著性差别。培养14 d后,MTT法检测显示,在效靶比为1∶1、5∶1和10∶1时3组杀伤效率均无显著差异(P>0.05)。结论:使用抗CD3 m Ab及IL-2,IL-15和IL-21培养单个核细胞,可获得高纯度和高杀伤活性的NK细胞。本研究为NK细胞的治疗提供了一个简单有效的方法。

CD4+Treg细胞对变应性鼻炎患者外周血单个核细胞的作用

目的探讨CD4+ Treg细胞对变应性鼻炎(AR)患者外周血单个核细胞(PBMCs)的作用。方法招募正常人(对照组)和AR患者(AR组)各15例,分别从两组志愿者外周血中获取PBMCs,接着从PBMCs中分离、提纯CD4+ Treg细胞,检测该细胞在总CD4+ T细胞中所占的百分比,并将其进行体外培养,然后检测CD4+ Treg细胞培养基中白介素(IL)-10和转化生长因子(TGF)-β及其mRNA的含量,最后,将体外培养的CD4+ Treg细胞加入到AR患者的PBMCs培养基中进行干预,并检测培养基中IL-4和IL-5的浓度。结果 AR患者CD4+Treg细胞(2.523±0.260)在总CD4+ T细胞中所占的百分比较对照组(4.716±0.390)减少,但AR组患者CD4+ Treg细胞培养基中IL-10(96.19±6.96 vs 33.69±3.88)和TGF-β(77.73±7.96 vs 31.39±3.15)及其mRNA(3.30±0.27 vs 0.26±0.05;3.29±0.26 vs 0.26±0.03)的含量却显著增多,AR组PBMCs培养基中IL-4(260.40±12.49)和IL-5(287.10±18.52)的浓度较对照组(23.07±3.26;19.62±2.46)为高,径AR患者的CD4+ Treg细胞干预后,AR患者PBMCs培养基中IL-4(120.60±9.58)和IL-5(137.60±12.33)的浓度显著降低,但对照组CD4+ Treg细胞的干预没有改变培养基中这些细胞因子(241.70±12.44;262.40±18.88)的含量。结论 CD4+ Treg细胞在变应性炎症状态下可以激活并起到抑制炎症的作用。

他克莫司抑制外周血单个核细胞培养上清对瘢痕疙瘩成纤维细胞的作用

目的:研究他克莫司(FK506)抑制外周血单个核细胞(PBMC)培养上清对瘢痕疙瘩成纤维细胞的作用,探讨FK506在瘢痕疙瘩治疗中可能的的作用和机制。方法:用消化法原代培养人瘢痕疙瘩来源的成纤维细胞,梯度密度离心法分离培养人PBMC。将瘢痕疙瘩来源的成纤维细胞随机分组,给予PBMC培养上清处理,实验组同时给与不同浓度FK506处理。四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖活性,荧光实时定量PCR法检测Ⅰ型胶原表达。结果:单纯给予PBMC培养上清处理后,成纤维细胞的增殖活性与对照组相比明显增高(P<0.01),同时给予PBMC上清和FK506时发现FK506在20 ng/ml和100 ng/ml时能够抑制PBMC上清的促增殖作用(P<0.01),荧光实时定量PCR结果显示:单纯给予PBMC培养上清处理后,Ⅰ型胶原的表达与对照组相比明显增高(P<0.05),给予PBMC上清和FK506后,在FK506浓度为20 ng/ml和100 ng/ml时Ⅰ型胶原表达降低(P<0.01)。结论:FK506能够抑制PBMC培养上清对瘢痕疙瘩成纤维细胞的作用,因此,FK506可能通过抑制PBMC的作用来达到预防和治疗瘢痕疙瘩的作用。

外周血单个核细胞与HepG2.215细胞共培养体系的研究

目的建立外周血单个核细胞与HepG2.215细胞共培养体系,探讨不同培养基及效靶比对共培养体系的影响。方法分离正常人外周血单个核细胞,加入植物血凝素(PHA),置于不同的培养基(DMEM、RPMI1640)中进行培养,采用不同效靶比(5∶1、10∶1、20∶1、40∶1)构建PBMCs与HepG2.215细胞共培养体系。用倒置显微镜观察细胞的形态及生长情况,台盼蓝拒染法检测PBMCs与HepG2.215细胞的细胞活力,cck-8法检测HepG2.215细胞的增殖活性。结果 DMEM培养基培养的HepG2.215细胞的细胞活力比RPMI1640培养基培养的细胞高;而两种培养基培养的PBMCs的细胞活力无明显变化。共培养条件下,PBMCs对HepG2.215细胞增殖活性的抑制作用随效靶比的不同而有所差别,效靶比为20∶1时抑制作用最强。结论在PBMCs与HepG2.215细胞共培养体系中,细胞培养基和效靶比对HepG2.215细胞的生长有影响。