尿嘧啶DNA糖基化酶在PCR防污染中的应用

1.PCR"残留污染" 在PCR操作过程中,最容易出现"污染"问题,原因主要有如下几种情况:①模板的交叉污染:在样品采集或处理中,气溶胶、加样器取样时的泡沫或其他原因引起样品或模板的交叉污染,造成假阳性,属于正常DNA(由A、T、G、C四种碱基组成)引起的污染;②扩增产物的污染:在扩增过程中,将碱基T置换成U,使得扩增产物为U-DNA(由A、U、G、C四种碱基组成),由于产物量特别大,容易溢漏引起污染,造成假阳性;③核酸酶、蛋白酶的污染造成假阴性;在这三种情况中最为严重是第二种,即称之为"残留污染",因为PCR扩增的放大倍数高达千万倍,而且在实际应用中扩增一直在反复进行,造成扩增产物的大量堆积,难于将其控制降解,即使是荧光PCR也很难避免扩增产物的污染,为了使得PCR结果更加可靠、准确,有必要在反应管完全封闭后于管内通过酶或其他方法,将操作过程中可能带入的残留污染物破坏,使其不能成为新一轮扩增的模板,从UDG的生物学性质可知,它是完成这一任务的最佳选择.