茯苓多糖合成途径磷酸葡萄糖变位酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因鉴定

采用已报道的灵芝磷酸葡萄糖变位酶(PGM)和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UGPP)基因序列对茯苓基因组进行搜索比对,获得茯苓WcPGM和WcUGPP候选基因序列;以茯苓的cDNA为模板,成功克隆获得WcPGM和WcUGPP基因;随后利用pPIC9K构建2个基因的表达载体,并转化至毕赤酵母进行异源表达。序列分析表明WcPGM和WcUGPP基因全长分别为2021 bp和2144 bp,其中WcPGM基因含有5个外显子和4个内含子,编码564个氨基酸;WcUGPP基因含有11个外显子和10个内含子,编码502个氨基酸。氨基酸序列比对表明,WcPGM和WcUGPP与来源于绣球菌的ScPGM和ScUGPP的同源性分别为87%和91%。酶活测定表明,重组酶WcPGM可转化葡萄糖-1-磷酸(G1P)为葡萄糖-6-磷酸(G6P),酶活达1540 U·mL^(-1);重组酶WcUGPP可催化G1P和尿苷三磷酸(UTP)合成UDP-葡萄糖(UDP-Glc),酶活达660 U·mL^(-1),表明从茯苓中筛选到的2个酶WcPGM和WcUGPP具有PGM和UGPP活性。分子模拟表明,WcPGM在催化可逆反应过程中S114为磷酸供体和受体,R24和K379作为催化酸和碱实现底物的磷酸化和去磷酸化,而E366和S368可实现底物的2种朝向,保障了中间产物葡萄糖-1,6-二磷酸的翻转,确保了WcPGM的可逆反应;而WcUGPP活性中心的核苷酸结合Loop和糖结合Loop保障了底物的正确朝向,K390作为催化碱实现了底物UTP/G1P与UDP-Glc的可逆反应。该研究为茯苓多糖合成途径的解析和代谢工程提升茯苓多糖产量奠定了基础。

龙须菜UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因的克隆及其表达与琼胶产量的关系

对红藻龙须菜(Gracilarialei maneiformis)UDP葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)基因的表达与不同藻株中藻体琼胶产量之间的相关性进行研究。通过PCR扩增的方法得到了龙须菜UGPase的基因序列。该基因cDNA序列的全长为2 200 bp,开放阅读框1 485 bp,编码494个氨基酸;龙须菜UGPase基因的氨基酸序列与其它物种的UGPase氨基酸序列相似性较高;该基因是单拷贝的,缺乏内含子;具有特殊的加尾信号。利用荧光实时定量PCR的方法检测UGPase基因相对表达量。结果表明,该基因的表达与琼胶含量存在显著相关性,即在高琼胶组藻株中的表达量显著高于低琼胶组藻株,对琼胶含量高低具有指示作用,显示了在产业化应用中的潜能。

坛紫菜UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(Phugp)的克隆及表达分析

UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)是红藻琼胶生物合成过程中的关键限速酶。以坛紫菜(Pyropia haitanensis)转录组测序获得的unigene序列为基础,采用RACE技术克隆获得了坛紫菜编码UGPase的基因序列:Phugp。序列分析结果表明:Phugp基因序列全长1734 bp,包含一个1530 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含510个氨基酸,相对分子质量为56.190 ku,等电点为6.24,具有UGPase特有的底物结合位点和红藻UGPase保守的N端和C端多肽结合位点。基因表达水平的定量分析结果表明:在不同程度的高温和高光胁迫条件下,Phugp基因的表达水平均极显著下调,而在不同程度的失水胁迫条件下,Phugp基因的表达则呈现为逐渐上调的趋势,说明Phugp基因在坛紫菜遭受不同的胁迫条件时呈现为不同的表达模式,并可能在应答失水胁迫中发挥着应激调节作用。

香菇UDP-葡萄糖焦磷酸化酶转录水平及酶活性对不同碳氮源的响应特征

以香菇新808为材料,利用苯酚-硫酸法和qPCR技术分析不同碳氮源下菌丝体多糖含量及尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因相对表达量,并测定其酶活性.结果表明,与对照组相比,除硝酸铵处理外,其余处理均能提高香菇菌丝体生物量,以麦麸处理的生物量最大(0.63g).以小分子糖(蔗糖、麦芽糖和甘露糖)为碳源、有机复合物(麦麸和黄豆芽)为氮源时,UGP基因表达量明显上调,酶活性更高,菌丝胞内多糖含量也明显提高.其中蔗糖和麦麸处理下的UGP基因表达量、酶活性和菌丝胞内多糖含量最高.香菇菌丝UGP基因表达量、酶活性以及胞内多糖间存在明显的正相关关系.显示小分子碳源(蔗糖、麦芽糖和甘露糖)、有机氮源(麦麸和黄豆芽)有助于香菇菌丝多糖的合成,其中蔗糖和麦麸可作为香菇液体发酵优势碳源和氮源.

茶树GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶基因cDNA全长的克隆与表达分析

抗坏血酸(Vc)是重要的抗氧化剂,在茶树体内的各种生理代谢及抵御非生物胁迫中起重要作用,Vc含量关系到绿茶品质优劣。GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶(GMP)是茶树Vc生物合成途径中的关键酶之一。本研究通过RACE-PCR方法从茶树中克隆了GMP c DNA全长序列,共计1510 bp,其中包含1 086 bp的开放阅读框(ORF),编码361个氨基酸,推测蛋白分子量为39.599 k Da。BLAST分析表明,茶树GMP基因氨基酸序列与猕猴桃的亲缘性最高,达到96%。实时定量PCR分析表明,茶树新梢芽下第三叶中GMP基因表达量最高,嫩茎中最低,不同品种茶树新梢叶片中表达量存在明显差异。高温胁迫初期,GMP基因表达量及抗坏血酸含量迅速升高,然后逐渐下降且均低于同期对照。

小麦蔗糖合成酶和腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的研究进展

植物蔗糖合成酶(SS)和腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)在植物淀粉生物合成过程中起着重要的作用,淀粉是小麦等禾谷类作物子粒胚乳的重要组成成分,与作物的产量和品质密切相关。综述了小麦蔗糖合成酶和腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的细胞定位生物学功能、分子生物学分析及酶活性的调控,并进一步对两种酶的研究作出设想。

超表达番茄GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶基因马铃薯对温度胁迫的响应

【目的】研究番茄GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因(GMPase)在马铃薯中的超表达对其抵御温度胁迫能力的影响。【方法】利用已经获得的超表达番茄GMPase的两个转基因马铃薯株系,用野生型马铃薯作对照,比较其在常温(25/20℃)、温度胁迫(10/5℃低温处理3 d,35/30℃高温处理3 d)及25/20℃恢复3 d后GMPase的相对表达量、抗坏血酸(AsA)含量及其相关生理指标的变化。【结果】在常温、温度胁迫与恢复阶段,与野生型植株相比,转基因马铃薯植株具有较高的GMPase相对表达量、GMPase活性、AsA和脱氢抗坏血酸(DHA)含量;高温和低温胁迫后,转基因马铃薯的脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)、单脱氢抗坏血酸还原酶(MDAHR)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性均明显提高,丙二醛(MDA)和H2O2含量及细胞质膜透性均明显降低。【结论】番茄GMPase在马铃薯中的超表达可能有提高马铃薯植株抵御温度胁迫的能力。

番茄GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶cDNA的克隆、表达及定位(英文)

GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶催化GDP-D-甘露糖的合成,是植物抗坏血酸生物合成途径中上游的关键酶。以马铃薯GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶cDNA序列为信息探针,在GenBankdbEST数据库中找到65条高度同源的番茄EST序列,通过序列拼接及RACE-PCR得到了番茄该基因的全长cDNA序列,命名为LeGMP。LeGMP与马铃薯GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶cDNA序列一致率为96%,推导的氨基酸序列与马铃薯、烟草、紫苜蓿、拟南芥的GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶基因的一致率分别为99%、97%、91%、89%。经Northern杂交分析,LeGMP在番茄根、茎、叶、花、果实中都有表达,但表达水平有差异。利用75个番茄远缘杂交重组系(IL系)将LeGMP定位在番茄第3染色体上的D区段(3-D)。

番木瓜GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶基因的克隆及分析

采用cDNA末端快速扩增方法,获得了番木瓜果实GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶(GMP)基因的cDNA全长序列,将其命名为CpGMP,GenBank登录号为FJ489652.然后,根据拼接序列设计开放性阅读框上、下游引物,扩增得到了CpGMP基因的开放性阅读框序列和DNA序列.ORF序列编码361个氨基酸,DNA序列包含4个外显子和3个内含子.序列分析表明,番木瓜GMP与大果黄褥花、桃、番茄、拟南芥、水稻GMP的同源性分别为90.30%、89.47%、88.92%、88.09%、85.87%.半定量RT-PCR分析表明,CpGMP基因随着番木瓜果实的成熟表达量逐渐增加,软化时又逐渐降低.

枣GDPD甘露糖焦磷酸化酶基因的克隆及生物信息学分析

GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶(GDP-D-mannose pyrophosphorylase,GMP)是植物As A生物合成的第一个关键酶,至今未见该基因在枣中的相关报道。本研究根据Gen Bank中登录的苹果、桃和草莓等植物GMP保守序列设计引物,采用同源克隆法,从"骏枣"果实中克隆出该基因并对其编码的蛋白进行了生物信息学分析。该基因包含完整的开放阅读框为1086bp,编码361个氨基酸残基,预测蛋白分子量为39.588ku,理论p I值为7.12,命名为Zj GMP(登录号KJ934995);序列分析表明,枣GMP与桃、葡萄、草莓、苹果GMP的相似性分别为88%、87%、87%和87%。进化树分析表明,该基因与桃、苹果和草莓等植物的GMP亲缘关系较近。

拟南芥GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因转化生菜的研究

维生素C是植物体内重要的抗氧化物质,同时也是人体所必需的营养物质。为了提高生菜中维生素C的含量,根据GenBank中拟南芥GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因(GMP)序列设计特异引物,从拟南芥cDNA中扩增出了GMP基因编码区片段,分别连上CaMV 35S启动子、MYC序列和NOS终止子后将含GMP基因的表达盒插入到植物表达载体pCAMBIA2301中,获得含有GMP基因的植物表达载体p2301-GMP-myc。通过农杆菌介导法转化生菜,获得了64株转基因植株,PCR检测以及荧光定量PCR分析证实外源基因已被成功导入生菜基因组中并表达。采用HPLC-ELSD测定转基因生菜中维生素C的含量。结果表明,大多数转基因生菜中维生素C的含量高于对照植株。转基因生菜中维生素C含量最高的约为对照的2.5倍。该研究证明过量表达GMP基因是提高生菜中维生素C含量的有效方法。

番茄叶片GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因表达载体的构建与转化

GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GMPase,EC 2.7.7.22)是维生素C合成途径的第一步关键酶。通过RT-PCR扩增到1498 bp的GMPase全长序列,GenBank登录号为DQ449030。利用克隆到的基因分别构建得到正义及反义植物表达载体。并将其克隆至PBI121真核表达载体,转化农杆菌LBA4404,利用农杆菌介导法转化烟草植株,经基因组PCR及琼脂糖凝胶电泳检测,结果表明GMPase真核表达载体构建成功,并成功获得转基因植株。

魔芋GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因及其启动子的克隆与分析

以花魔芋和白魔芋为材料,通过魔芋5个转录组高通量测序数据库,与拟南芥进行tBlastn比对、拼接,得到魔芋中的GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因GMP的推定全长,设计基因特异性引物,克隆得到魔芋GMP基因的部分cDNA序列,长度为1 233 bp,其中基因编码区长度为1 086 bp,编码的氨基酸为361个.在此基础上运用FNPI-PCR技术得到了魔芋GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因GMP上游启动子2 116 bp,经生物信息学分析,该序列具有典型的TATA-box、 CAAT-box及与胁迫相关的元件和光应答元件.

多花黄精果糖激酶和GDP-甘露糖焦磷酸化酶的基因克隆及酶结构性质

多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua,PC)果糖激酶(PCFRK)和GDP-甘露糖焦磷酸化酶(PCGMPP)是黄精多糖生物合成中重要的关键酶,为探究它们在黄精多糖生物合成途径中的作用,基于转录组测序数据分析,利用RT-PCR技术对这两种关键酶基因进行克隆,并分析酶蛋白的理化性质及结构特点。PCFRK开放读码框(ORF)为1725 bp,编码574个氨基酸,具有两个磷酸果糖激酶B家族的特征保守基序;PCGMPP的ORF为1086 bp,编码361个氨基酸,具有焦磷酸化酶家族的保守位点和活性位点。系统进化树分析发现在已知数据库中PC FRK与深圳拟兰FRK亲缘关系最近;而PC GMPP与芦笋GMPP亲缘关系最近。基因表达分析说明PCFRK和PCGMPP在根状茎中的基因表达总量明显高于其他组织,这与多花黄精根茎中多糖含量高于其他组织是一致的。研究为PCFRK和PCGMPP两种关键酶功能的进一步研究及黄精多糖生物合成途径的解析奠定基础。

糖核苷酸的生物合成和应用

糖基化是生物体中最重要的反应之一,通过糖基化作用可以形成具有多种生物功能的糖缀合物。糖核苷酸作为Leloir型糖基转移酶催化的转糖基反应的糖基供体,在聚糖和糖缀合物的生物合成中必不可少。然而,糖核苷酸的成本较高、可用性有限等因素阻碍了生物催化级联反应在工业中大规模的应用。因此,人们越来越关注糖核苷酸的合成策略,以实现其在多种领域的广泛应用。目前,糖核苷酸及其衍生物的化学合成方法已经建立起来,但合成反应的产量通常很低,而酶法(化学-酶法)和细胞工厂法在合成糖核苷酸过程中具有显著优势。本文主要围绕哺乳动物中常见的9种糖核苷酸,概述了其类型和结构、酶法(化学-酶法)和细胞工厂法两种制备方法。伴随糖核苷酸的高效合成,其多种功能逐渐被发现和应用。本文进一步概述了糖核苷酸在聚糖及糖缀合物合成、糖基转移酶生化性质表征以及生物正交标记策略等方面的应用,对生物化学、糖生物学的研究以及相关医药产品的研发具有十分重要的意义。

植物中的糖代谢及其相关酶

概述了糖在植物代谢、生长、发育中的作用 ,总结了糖代谢相关反应及相关的酶 :如尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶、转化酶、己糖激酶的亚细胞定位 ,酶学特性。论述了通过转基因等手段探知的这些相关酶的生物学作用。

植物UDP-葡萄糖焦磷酸化酶家族基因鉴定及序列进化分析

UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UDP glucose pyrophosphorylase, UGP)是糖代谢合成途径中的一个关键酶。UGP以葡萄糖-1-磷酸和尿苷三磷酸为底物,催化反应生成尿苷二磷酸葡萄糖和焦磷酸,直接参与了植物糖代谢的生物合成。为了系统梳理UGP在植物基因组中的状况,我们对其基因进行了全面的鉴定和进化分析,并重点考察该基因在番茄中的表达。首先,我们针对UGP的基因序列,鉴定得到其保守结构域,在此基础上对相关基因进行了全面鉴定,从而构建了其进化树;其次,将番茄CDS序列比对到各探针,从而从数据库中提取组织中的表达数据;最后,通过结构域鉴定,进化树和表达量的分析,得出UGP在植物中的生物合成的机理。本研究为UDP-葡萄糖焦磷酸化酶提供了基因信息,为植物中糖代谢生物合成途径的作用机理及其对蔗糖合成的影响相关基因进化机制的研究提供帮助。

植物尿苷二磷酸糖焦磷酸化酶研究进展

尿苷二磷酸糖焦磷酸化酶(UDP-sugar-producing pyrophosphorylase)是糖代谢过程中的一类重要酶,负责催化尿苷二磷酸糖(UDP-sugar)的合成与代谢。本研究综述了3种类型植物UDP-糖焦磷酸化酶在进化关系、结构特性、蛋白定位、寡聚化方式以及生理功能等方面的研究进展,为进一步明确UDP-糖焦磷酸化酶的相关性质及其在植物糖代谢过程中的重要作用提供依据。

鸟苷二磷酸甘露糖焦磷酸化酶β亚基基因突变致肢带型肌营养不良合并先天性肌无力综合征

目的报道4例鸟苷二磷酸甘露糖焦磷酸化酶β亚基（GMPPB）基因突变所致继发性肌营养不良蛋白聚糖病的病例,并结合文献对本病的临床表现、肌肉影像、分子病理及遗传学特点进行分析.方法收集2009—2017年在我院门诊就诊的继发性肌营养不良蛋白聚糖病2个家系共4例患者的详细病史、体格检查、肌电图和其他辅助检查结果,分析家系1和家系2的2例先证者的肌肉影像、肌肉活体组织检查病理特点,并对该2例患者行靶向二代基因测序.结果4例患者来自2个家系（其中3例来自同一家系）,男性2例,女性2例,发病年龄为17-18岁.临床上符合肢带型肌营养不良（LGMD）和先天性肌无力综合征（CMS）重叠表型,表现为四肢近端肌无力,且具有日间波动性,晨轻暮重.患者早期跑跳不如同龄人,体育成绩差.体检双下肢近端肌力Ⅰ-Ⅱ级,双上肢近端肌力Ⅲ-Ⅳ级,四肢远端肌力Ⅴ级.脊旁肌和四肢近端肌萎缩,腓肠肌肥大.实验室检查：肌酸激酶明显升高（1877-5275U/L）,针极肌电图呈肌源性损害,重频刺激试验示低频递减.肌肉MRI表现为大腿后群肌（腘绳肌）显著脂肪变性;肌肉病理呈肌营养不良改变.靶向二代基因测序均显示GMPPB基因复合杂合突变,家系1突变位点为c.860G〉T（p.R287L）/c.851T〉C（p.V284L）;家系2突变位点为c.1097A〉G（p.N366S）/c.589G〉T（p.V197F）.上述4个突变位点均为新发突变,经家系验证提示2个突变分别来自患者父母.免疫组织化学及蛋白质电泳分析证实2例先证者肌肉组织α-肌营养不良蛋白聚糖的表达水平均较正常对照明显下降.4例患者经溴吡斯的明治疗后肌无力症状均有不同程度的改善.结论GMPPB基因突变可致肌肉和神经肌肉接头同时受累,临床表现为LGMD与CMS重叠.胆碱酯酶抑制剂能部分改善此类患者肌无力症状.

金发草GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶基因的克隆及功能分析

通过RACE-PCR技术克隆得到金发草GMP基因的cDNA全长序列,命名为PpGMPase(GenBank序列号:KF586841).该基因开放阅读框长度为1086bp,编码361个氨基酸,分子式为C1787H2874N474O509S17;DNA序列由4个外显子和3个内含子组成;该基因与玉米、水稻、猕猴桃、烟草、拟南芥、番木薯等植物GMP基因具有较高的同源性,与二穗短柄草亲缘关系最近.采用荧光定量PCR方法对该基因响应非生物胁迫(盐、干旱和冷胁迫)的表达模式进行分析,结果表明:在高盐、干旱及低温胁迫后GMP基因的表达量都有显著性增加,并且其催化产物抗坏血酸含量也随之增加.