转UDP-葡萄糖:类黄酮3-O-糖基转移酶基因的高山红景天叶绿素荧光特性

以高山红景天为试材,采用IMAGING-PAM调制叶绿素荧光成像系统,测定了转UDP-葡萄糖:类黄酮3-O-糖基转移酶基因FaGT1的高山红景天及转FaGT1的RNAi作用基因FaGT1i的高山红景天的叶绿素荧光参数,分析转UDP-葡萄糖:类黄酮3-O-糖基转移酶基因的高山红景天叶片的叶绿素荧光特性,为研究红景天种质改良提供科学依据。结果表明:当光照强度为55μmol·m^(-2)·s^(-1)时,转FaGT1基因高山红景天的光系统Ⅱ的最大量子产量与高山红景天对照组和转FaGT1i基因高山红景天无显著差异,光系统Ⅱ潜在活性、非光化学淬灭系数/光化学淬灭系数和实际量子产量显著高于高山红景天对照组和转FaGT1i的高山红景天,但是调节性能量耗散的量子产量、非调节性能量耗散的量子产量则相对较低。另外,通过在不同的光照强度下,对光系统Ⅱ电子传递速率、光化学淬灭系数和非光化学淬灭系数进行了分析,得出转FaGT1基因高山红景天的光系统Ⅱ电子传递速率、非光化学淬灭系数呈先上升后稳定的趋势,显著高于高山红景天对照组和转FaGT1i的高山红景天;但是光化学淬灭系数呈先下降后平稳的变化趋势,与对照及转FaGT1i基因高山红景天无显著差异。转FaGT1基因高山红景天的光系统Ⅱ原初光能转换效率和潜在的光合活力均增强,植物自身的能量代谢得到提高,该研究结果为高山红景天的新种质培育提供了科学依据。

黏虫UDP-葡萄糖基转移酶UGT33J12基因序列分析及对两种杀虫剂的响应

UDP-葡萄糖基转移酶是昆虫体内重要解毒代谢酶,对昆虫抗药性发挥重要作用。研究基于转录组测序获得一条黏虫UDP-葡萄糖基转移酶cDNA序列,经UGT国际命名委员会命名为UGT33J12(GenBank登录号:MT873954)。该序列全长1 798 bp,含有1个开放阅读框,长度为1 557 bp,编码518个氨基酸组成的多肽,分子质量约为58.95 ku,等电点为8.62。UGT33J12基因编码氨基酸N端区域包含一个长度为20个氨基酸信号肽序列,以及起催化作用的组氨酸(H)和天冬氨酸(D);C端区域包含两个供体结合区和一个保守特征性基序;在供体结合区中鉴定得到8个关键氨基酸残基。高效氯氟氰菊酯LD10处理黏虫四龄幼虫12、24和48 h,LD30、LD50处理黏虫12和24 h,该基因表达量上调;氯虫苯甲酰胺LD10处理黏虫四龄幼虫24、48 h,LD30处理黏虫3、12、24和48 h,LD50处理黏虫3、24和48 h,基因表达量均上调。结果表明,该基因可能参与黏虫对高效氯氟氰菊酯和氯虫苯甲酰胺两种杀虫剂解毒代谢过程。

山葡萄UDP-葡萄糖:类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶基因(3GT)cDNA的克隆和分析

用RT-PCR和SMARTRACE技术克隆了山葡萄3GT基因的全长cDNA序列。GenBank登录号为FJ169463,3GTcDNA全长1477bp,包括开放阅读框1371bp,编码456个氨基酸,该基因表达产物相对分子质量为50.19kDa,等电点为5.98,是不稳定蛋白。该基因属于UGT超基因家族,不包含信号肽。氨基酸序列与欧亚种葡萄(AB047098)、美洲种葡萄(EF630356)和拟南芥(AY072325)等植物的3GT氨基酸序列的同源性系数分别为98%、97%和59%。

山葡萄UDP-葡萄糖:类黄酮5-O-葡萄糖基转移酶(5GT)等位基因的克隆与分析

山葡萄中大量的双糖苷花色苷严重影响山葡萄酒品质,而5GT是合成双糖苷花色苷的关键酶。研究不同葡萄品种间5GT等位基因的差异,为抑制双糖苷花色苷的合成奠定基础,对提高山葡萄酒的品质有重要意义。本研究克隆了‘赤霞珠’、‘左山一’、‘哈桑’和‘左红一’中的5GT等位基因,并用软件对其进行了序列分析和生物信息学分析,共获得了7个5GT等位基因,均位于葡萄9号染色体上,分别编码297~464个氨基酸。序列分析结果表明,4个5GT等位基因由于基因突变可能丧失了5GT功能;7个5GT等位基因均没有信号肽,属于GT1家族中的5GT亚家族。不同葡萄品种中的5GT等位基因存在一定差异,推测这7个5GT等位基因中可能只有3个5GT可以合成双糖苷花色苷。

葡萄糖神经酰胺合成酶在肿瘤多药耐药中的研究

葡萄糖神经酰胺合成酶（GCS）参与神经酰胺（Cer）糖基化代谢途径，能阻断Cer对细胞凋亡信号的转导。研究表明在多种肿瘤多药耐药细胞株中GCS含量增加且与耐药表型相关，GCS和P-糖蛋白（P-gp）在细胞耐药的生物学机制中有相关性。通过化学抑制剂以及RNA干扰技术下调GCS的水平和活性能增强肿瘤细胞对药物的敏感性。因此，抑制GCS是逆转肿瘤多药耐药的一种新机制。

管纹艳虎天牛UDP-葡萄糖基转移酶基因的鉴定及表达特征分析

【目的】昆虫UDP-葡萄糖基转移酶(UGT)在其内源性和外源性有毒化合物的解毒代谢过程中起着重要作用,但在管纹艳虎天牛Rhaphuma horsfieldi中UGT基因的研究尚属空白。【方法】采用转录组学、生物信息学、进化和表达谱分析、蛋白同源建模等技术研究了管纹艳虎天牛的UGT基因家族。【结果】从管纹艳虎天牛转录组中一共鉴定到36个RhorUGTs基因,其中17个具有全长序列。鞘翅目不同种间UGT基因数量的比较表明,管纹艳虎天牛具有中等数量的UGT基因。进化分析结果表明,RhorUGTs分布在10个亚家族中,其中UGT352亚家族为天牛科昆虫所特有,且该亚家族中RhorUGT2/7/10/16/18/27可能通过基因的复制产生。表达谱结果表明,大部分RhorUGTs基因在检测的所有组织中均有表达,部分基因呈现触角或跗节特异或高表达的特点,暗示它们具有嗅觉或触觉等功能。三级结构分析发现,RhorUGT17的α3、α4、β4和β5主要参与UDP-葡萄糖的结合。【结论】本研究明确了管纹艳虎天牛UGT基因的数量、序列特征、进化关系及组织表达特征,研究结果为该种天牛解毒代谢机制的阐明奠定基础。

‘红巴梨’果皮UFGT基因的克隆及表达分析

以‘巴梨’红色芽变品种‘红巴梨’果皮为材料,采用同源克隆技术和RACE结合的方法,克隆了UFGT(UDP-葡萄糖:类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶)蛋白的部分cDNA,命名为Pc UFGT。结果表明:该cDNA片段长为1 089 bp,与苹果UFGT基因序列一致性达89%,氨基酸序列同源性为85%,含有糖基转移酶的UDPGT、COG1819和MGT等保守域。荧光实时定量PCR分析表明,该基因在‘红巴梨’幼果期表达强度约为‘巴梨’的2倍,而果实成熟期表达强度略低于‘巴梨’;该基因在‘红巴梨’果肉中不表达。

丙型肝炎病毒功能基因在CHO细胞中的表达研究

丙型肝炎病毒(HCV)与宿主细胞因子的相互作用已经成为国内外研究的热点和难点。近期研究已经证实HCV的感染对宿主多种途径中基因的转录均能产生影响。为了进一步研究究竟是HCV中的哪些功能基因在与特定细胞因子的相互作用中起主导作用,构建了分别含有HCV Core、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B基因的真核表达质粒,分别转入宿主细胞CHO-K1中,在G418的选择压力下筛选获得稳定表达HCV单个蛋白的细胞系(10株)。PCR和RT-PCR可分别从稳定细胞系中检测到相应的HCV基因的DNA和mRNA,冻存和复苏不会造成HCV基因的丢失。Western-blot检测到稳定细胞系中表达E1,E2和NS5B蛋白,说明HCV基因在CHO-K1中已经形成稳定表达。薄层层析(TLC)结果显示,含有不同HCV基因的稳定传代细胞系中,UDP-葡萄糖神经酰胺葡萄糖基转移酶(UGCG)活性均发生了不同程度的变化,其中E2和p7的表达使胞内UGCG的活性提高了约1倍,NS2和NS5A则使UGCG的酶活提高了约0.6倍。该稳定细胞系的建立为研究病毒与宿主因子的相互作用及药物筛选奠定了基础。

UGCG通过调控MDR1/P-gp参与人结肠癌奥沙利铂耐药的初步研究

目的建立人结肠癌耐奥沙利铂(L-OHP)细胞株,检测该细胞株的多药耐药性并初步探讨其可能的耐药机制。方法以人结肠癌细胞HCT116为对象,采用药物浓度梯度递增诱导法建立人结肠癌耐奥沙利铂细胞株HCT-116/L-OHP。CCK-8法检测L-OHP、顺铂(DDP)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)对亲本细胞和耐药细胞株的半数抑制浓度(IC50)。使用UDP-葡萄糖神经酰胺糖基转移酶(UGCG)si RNA转染HCT-116/L-OHP细胞,实时荧光定量PCR和Western blot检测干扰前后UGCG基因和多药耐药基因1(MDR1)mRNA及其编码的蛋白表达水平。结果 HCT-116/L-OHP对L-OHP的耐药指数为10.5,与DDP有一定程度的交叉耐药,耐药指数为4.61,但对5-Fu无交叉耐药。耐药细胞HCT-116/L-OHP中UGCG、MDR1 mRNA和UGCG、P-糖蛋白(P-gp,MDR1编码的蛋白)表达均增加,相比HCT-116细胞,差异具有统计学意义(P<0.05)。UGCG si RNA成功抑制HCT-116/L-OHP细胞中UGCG的表达,各干扰组MDR1 mRNA、P-gp表达减少,与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建了人结肠癌耐药细胞株;UGCG基因通过调控MDR1/P-gp的表达参与人结肠癌奥沙利铂的耐药机制的形成。

芜菁UF3GT基因的克隆及表达特性

目的：克隆‘津田’芜菁和‘赤丸’芜菁的UDP-葡萄糖：类黄酮3-0-葡萄糖基转移酶（UF3GT）基因并研究其表达特性。方法：利用RT-PCR方法克隆‘津田’芜菁BrUF3GTl基因和‘赤丸’芜菁BrUF3GT2基因，并进行生物信息学分析；通过Northern杂交检测BrUF3GTl和BrUF3G死基因的UV-A诱导表达特性；对BrUF3GTl和研U乃G他基因进行原核诱导表达。结果：BrUF3GTl和BrUF3GT2的开放读框为1407bp，编码468个氨基酸残基；氨基酸序列分析显示，BrUF3GTl和BrUF3GT2与拟南芥UF3GT的同源性为87％，从第16～453位氨基酸残基的肽段具有糖基转移酶家族成员的结构域；所UF3G丌和BrUF3GT2基因具有高度同源性，核苷酸序列在7个位点存在差异，推导的氨基酸序列在1个位点存在差异；Northern杂交结果显示，UV-A可以诱导西＂3G＂和BrUF3GT2基因表达，基因的表达量与处理时间相关；原核诱导表达及纯化后可以获得相对分子质量分别约为51．88×10。和51．89~10。的BrUF3GTl和BrUF3GT2蛋白。结论：克隆了‘津田’芜菁和‘赤丸’芜菁的叩3Gr基因，为初步阐明2种芜菁的花青素生物合成机理奠定了实验基础。

构建高效糖配体再生重组菌生物催化合成莱鲍迪苷D

利用拟南芥(Arabidopsis thaliana)蔗糖合酶AtSUS3构建活化糖配体尿苷二磷酸葡萄糖(uridine diphosphate glucose,UDPG)再生体系,与高效催化莱鲍迪苷D(rebaudioside D,RD)合成的糖基转移酶协同偶联完成RD的高效生物催化。从拟南芥cDNA克隆获得AtSUS3基因,将其装配至pET28a获得表达质粒pLW105,随后pLW105与携带糖基转移酶EUGT11基因的质粒共转化大肠杆菌BL21(DE3)构建双酶共表达工程菌。在不添加UDPG或者尿核苷二磷酸(uridine diphosphate,UDP)的条件下,以上述双酶共表达工程菌全细胞催化莱鲍迪苷A(RA)获得的底物摩尔转化率大于80%,RD产量达到930 mg/L。随后构建双酶基因串连质粒pLW108及双酶共表达大肠杆菌BL21(DE3)工程菌。用串连质粒构建的工程菌催化效果与双质粒共转化相同。采用共表达双酶工程菌的发酵破碎粗酶进行催化,结果显示以粗酶催化可简化催化体系,并可将细胞催化体系所需高质量浓度蔗糖用量降至质量浓度5 g/100 mL,同时在不添加外源UDPG的条件下实现RD的高效生物催化,RA底物摩尔转化率达到93%,RD产量约为1 051 mg/L。

重组地衣芽胞杆菌全细胞催化合成淫羊藿次苷D2

分别利用糖基转移酶YjiC、YdhE、YojK的过表达载体电转化地衣芽胞杆菌DW2,相应获得重组菌株ID02、ID03和ID04,并借助pgcA和gtaB基因强化菌株ID02中的UDP-葡萄糖代谢途径来获得重组菌株ID05,研究了基因改造及发酵条件对淫羊藿次苷D2产量的影响。结果表明,YjiC、YdhE、YojK均可糖基化酪醇合成淫羊藿次苷D2,且三者酶催化活性依次减弱;强化UDP-葡萄糖代谢途径并不能促进淫羊藿次苷D2的合成;经正交试验优化后的发酵培养基中NH 4Cl为3 g/L、磷酸缓冲盐为75 mmol/L,菌株ID02在此条件下发酵48 h时相应的淫羊藿次苷D2的产量可达到4010 mg/L。

甜菊醇糖苷生物合成关键基因的导入和鉴定分析

甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)生产的甜菊醇糖苷因具有高甜度、低热能、不参与人体内代谢兼具保健功能等特点,被誉为最有发展前途的新糖源。从甜叶菊叶片克隆了甜菊醇糖苷生物合成途径中的关键基因SrUGT85C2、SrUGT91D2m和SrUGT76G1,构建植物基因过量表达载体,以单独或组合的形式将这些基因导入到甜叶菊中,获得转基因植株。与野生型对照植株相比,单独导入SrUGT85C2的转基因植株中甜菊醇单糖苷含量提高,总糖苷、莱包迪苷A含量及占比没有明显变化;单独导入SrUGT91D2m的转基因植株中甜菊醇单糖苷含量显著降低,而甜菊醇双糖苷含量显著增加;单独导入SrUGT76G1的转基因植株中,总糖苷含量显著提高,莱包迪苷A含量达到10%以上,比对照提高了2倍,而甜菊糖苷含量减少了一半。3个基因组合同时导入的转基因甜叶菊植株与单独导入SrUGT76G1的转基因甜叶菊植株类似,其总糖苷、莱包迪苷A含量及其占比均显著提高。这些结果为以后通过分子生物学技术来调控甜菊醇糖苷生物合成关键基因的表达,培育莱包迪苷A含量高的高品质甜叶菊新品系提供了理论依据和技术方法。

糖基转移酶基因TaUGT7分子表达特征及抗赤霉病作用分析

为研究小麦UDP-葡萄糖基转移酶7(UDP-glycosyltransferase 7,TaUGT7)的抗赤霉病功能,利用DNAMAN 6.0软件对Ta UGT7及其同源蛋白进行序列比对,应用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术分析经赤霉菌Fusarium graminearum和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)处理后的苏麦3号小穗中TaUGT7基因的表达特征,利用基因枪在洋葱表皮细胞瞬时表达TaUGT7-eGFP进行亚细胞定位,采用农杆菌介导法在小麦品种Fielder中过量表达TaUGT7基因并进行赤霉病抗性鉴定。结果表明,TaUGT7在氨基酸序列上与已知赤霉病抗性相关UGT相似性较低;TaUGT7在赤霉菌接种24 h后开始被诱导表达,在DON处理2 h后逐步被诱导表达;Ta UGT7蛋白亚细胞定位于细胞膜和细胞核中;qRT-PCR检测发现,TaUGT7在8株独立的过表达转基因株系中均有不同程度的上调表达;与野生型对照相比,过表达株系TaUGT7-395和TaUGT7-457中的平均病小穗率显著下降。表明TaUGT7可以被赤霉菌和DON诱导表达,并在小麦抗赤霉病过程中发挥作用。

散发性静脉畸形发病机制分子研究进展

静脉畸形(venous malformation,VM)是一种儿童常见的先天性脉管疾病,其中95%的病例表现为散发性。大多数临床症状表现为蓝色、柔软、可被压缩的低流速或中流速血流的血管性病灶。目前,介入硬化术是常见的治疗方法,而手术切除仅在少数病例中被采用。介入硬化术的疗效与病灶内血流速度,以及病灶范围等密切相关。范围较大、弥漫性病灶的治疗次数会增多,且疗效显著的比例低于孤立性小病灶,术后复发率也较高。对于病灶累及周围正常组织严重的病例,强烈的硬化剂注射治疗可能会对受累组织造成极大的损伤。截至目前,静脉畸形的发病机制尚未完全阐明。为了探索更有效的治疗方式,如分子靶向药物治疗,以取得更好的临床疗效,探索静脉畸形的发病机制具有十分重要的意义。文章将就散发性静脉畸形分子研究的进展进行综述。

栽培黄芩生长过程中CHS和UBGAT表达及黄芩苷积累动态研究(英文)

分别采用荧光实时定量PCR和高效液相色谱法分析测定了4月到10月栽培黄芩生长过程中CHS(查尔酮合酶)及UBGAT(UDP-葡萄糖醛酸:黄芩素7-O-葡萄糖醛酸基转移酶)表达水平和黄芩苷含量的动态变化规律.结果表明CHS及UBGAT表达水平均在6月份和8月份达到高峰,而黄芩苷含量的最高峰出现在8月份.研究结果提示在黄芩栽培过程中,6月份和8月份是黄酮类合成和积累的关键时期,因此在这两个月加强田间管理对于提高黄芩药材的质量至关重要.

药用植物质量标志物多糖生物合成通路及关键酶研究进展

多糖是众多药用植物中重要的质量标志物,在免疫调节、抗肿瘤等方面具有显著的药理作用。多糖是一类结构复杂、种类繁多、组合多样的生物大分子,其生物合成通路主要包括蔗糖转化、尿苷二磷酸葡萄糖(uridine diphosphate,UDP)-葡萄糖至其他NDP单糖的转化、多糖聚合3个部分。在这一合成过程中涉及的关键酶主要包括蔗糖合成酶(sucrose synthase,SUS)、果糖-6磷酸酯在蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase,SPS)、蔗糖由转化酶(invertase,INV)、己糖激酶(hexokinase,HK)、果糖激酶(fructokinase,FRK)、UDP-葡萄糖脱氢酶(UGDH)、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase,UGPase)、UDP-鼠李糖合成酶(UDP-rhamnose synthase,RHM)、磷酸甘露糖突变酶(phosphomannose isomerase,PMM)、GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GDP-mannose pyrophosphorylase,GMPP)、糖基转移酶(glycosyl transferases,GTs)等。选取以多糖为主要质量标志物的药用植物为探讨对象,对其多糖生物合成通路、关键酶作用机制及单糖组成进行归纳分析,并对研究中存在的问题和可能的解决思路进行了梳理和展望。对明确药用植物质量标志物多糖生物合成通路,了解关键酶作用机制具有一定的参考价值。

表达蝎毒素的重组斜纹夜蛾核型多角体病毒(SpltMNPV)的构建及毒力

【目的】开发高毒力的重组斜纹夜蛾核型多角体病毒(Spodoptera litura multicapsid nucleopolyhedroviruse,SpltMNPV)杀虫剂。【方法】构建编码蜕皮激素UDP-葡萄糖基转移酶(ecdysterioid UDP-glucosyl transferase gene,egt)基因缺失并插入东亚钳蝎神经毒素(B.martensi Karsch,BmK ITa1)基因的重组转移载体,重组转移载体与SpltMNPVⅡ基因组DNA共转染斜纹夜蛾细胞,通过荧光斑法与有限稀释法相结合筛选重组病毒。【结果】成功筛选出缺失egt基因的、早期启动子(ie-1)启动的、表达BmK ITa1成熟肽的重组病毒SpltMNPV-Δegt-Pph-egfp-ie-1-BmK ITa1。生物测定结果显示,重组病毒的杀虫速度(LT50)较野生病毒提前0.7-0.8 d。【结论】通过在SpltMNPV病毒基因组中插入外源毒素基因可明显增强病毒的杀虫效果,结果说明开发高毒力SpltMNPV生物杀虫剂具有可行性。