金柑UDP-鼠李糖合成酶基因的克隆与功能解析

以‘浏阳金柑’为研究材料,克隆到2个UDP-鼠李糖合成酶(UDP-Rhamnose synthase,RHM)基因FcRHM1和FcRHM2的全长。FcRHM1的开放阅读框(ORF)长度为2007 bp,编码668个氨基酸,分子量为75.3 kD;FcRHM2的ORF长度为2031 bp,编码676个氨基酸,分子量为76.2 kD。多序列比对显示,FcRHM与其他植物的RHM蛋白序列高度相似。亚细胞定位显示FcRHM1和FcRHM2定位于细胞质和细胞核。原核表达及体外酶促反应结果显示,FcRHM1和FcRHM2均可将UDP-葡萄糖转化为UDP-鼠李糖。组织特异性表达显示,FcRHM1和FcRHM2在不同组织中表达量存在一定的差异。结合UDP-鼠李糖的积累模式,认为FcRHM1和FcRHM2可能都参与了UDP-鼠李糖的合成,但FcRHM1对于花和果实中UDP-鼠李糖的合成更为关键,而FcRHM2则主要负责叶片及芽的UDP-鼠李糖的合成。

广佛手UDP-鼠李糖合成酶基因的克隆及功能鉴定

目的对广佛手Citrus medica var.sarcodactylis中参与合成UDP-鼠李糖的UDP-鼠李糖合成酶(UDP-rhamnose synthase,RHM)基因进行全长cDNA克隆、功能鉴定及差异表达分析。方法基于广佛手转录组数据,筛选和克隆广佛手鼠李糖合成酶基因(CmRHM1)的全长cDNA,并对其进行生物信息学分析;构建原核表达载体,通过体外酶促反应鉴定CmRHMl的功能;利用实时荧光定量PCR分析广佛手不同器官中CmRHM1基因的表达特性。结果CmRHM1基因的开放阅读框(ORF)长度为2007 bp,编码668个氨基酸。该基因编码蛋白的相对分子质量为75330、理论等电点是6.97,为亲水蛋白,无信号肽。多重序列比对显示CmRHMl在序列的N-端和C-端均含有高度保守的2个结构域(GxxGxxG/A和YxxxK)。体外酶促反应结果表明CmRHMl蛋白具有催化UDP-Glc合成UDP-Rha的功能。实时荧光定量结果显示该基因在广佛手的茎、叶和果实中的表达水平依次为叶>果实>茎。结论CmRHM1基因的功能鉴定为UDP-鼠李糖及鼠李糖糖苷的生物合成奠定了物质基础。

甜橙中UDP-鼠李糖合成酶基因CsRHM的克隆与鉴定

UDP-鼠李糖是一种由鼠李糖合成酶(rhamnose synthase,RHM)催化合成的糖苷供体,是合成各种鼠李糖糖苷类次生代谢产物的重要组成之一。该研究从甜橙中首次克隆得到一个RHM基因(CsRHM),并进行生物学信息分析,体外功能鉴定等特异性分析。结果显示CsRHM的开放阅读框为2007 bp,编码668个氨基酸,推测相对分子质量为75.27 kDa,理论等电点为6.97,具有RHM酶家族的特征信号序列(GxxGxxG/A和YxxxK)。多序列对比与系统进化树显示,CsRHM与其他物种的RHM具有同源性。体外酶促反应结果证实CsRHM重组蛋白具有将UDP-葡萄糖转化为UDP-鼠李糖的催化活性,并且明确了其催化的酶动力学参数V_(max)=0.3737μmol·L^(-1)·min^(-1),K_(m)=21.29μmol·L^(-1),K_(cat)=0.24 s^(-1),K_(cat)/K_(m)=1.13×10^(4)s^(-1)·L·mol^(-1)。该研究首次报道了CsRHM,并验证了其体外催化功能,为进一步研究生物合成UDP-鼠李糖奠定基础。

何首乌中UDP-鼠李糖合成酶基因FmRHM1/2的克隆与鉴定

UDP-鼠李糖是一种由UDP-鼠李糖合酶(RHM)催化合成的鼠李糖供体,而鼠李糖是鼠李糖苷化合物的重要组成部分,植物中只有少数基因编码的酶参与UDP-鼠李糖生物合成。本研究基于何首乌(Fallopia multiflora(Thunb.) Harald.)转录组数据,首次克隆得到2个RHM基因(FmRHM1和FmRHM2),并进行生物学信息分析、体外功能鉴定及组织特异性分析。结果显示FmRHM1/2基因的开放阅读框均为2 013 bp,均编码670个氨基酸,推测蛋白质分子质量均为75.6 kDa,理论等电点分别为6.20和7.19,具有RHM酶家族的特征信号序列(GxxGxxG/A和YxxxK);多序列比对与系统进化树显示, FmRHM与其他物种的RHM具有同源性。体外酶促反应结果显示,重组蛋白FmRHM1和FmRHM2均具有催化活性,可将UDP-葡萄糖转化为UDP-鼠李糖。组织特异性表达显示, FmRHM1和FmRHM2基因在根中的表达量最低,并与茎和叶相比均存在显著性差异。本研究首次报道了何首乌RHM,并验证了其催化功能,为进一步研究微生物合成UDP-鼠李糖奠定基础。