毛细管电泳在UDPG-甜菊苷葡萄糖基转移酶活性测定中的应用

以Tris-硼酸作为毛细管电泳分离分析甜菊糖苷新体系,分离测定UDPG-甜菊糖苷葡萄糖基转移酶在适当条件下催化甜菊醇反应后的甜菊糖苷产物。结果表明,甜菊种子经能量75keV,剂量1014ions/cm2的碳、氮离子注入处理,UDPG-甜菊糖苷葡萄糖基转移酶活性比未进行离子注入的高;而且碳离子注入效果好于氮离子注入。因此,毛细管电泳可以作为离子注入处理植物种子检测的新方法,与文献报道的非Tris-硼酸体系相比,具有性能稳定、缓冲容量大、分离分析速度快、线性范围宽及分辨能力强等优点。

甜菊醇糖苷生物合成关键基因的导入和鉴定分析

甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)生产的甜菊醇糖苷因具有高甜度、低热能、不参与人体内代谢兼具保健功能等特点,被誉为最有发展前途的新糖源。从甜叶菊叶片克隆了甜菊醇糖苷生物合成途径中的关键基因SrUGT85C2、SrUGT91D2m和SrUGT76G1,构建植物基因过量表达载体,以单独或组合的形式将这些基因导入到甜叶菊中,获得转基因植株。与野生型对照植株相比,单独导入SrUGT85C2的转基因植株中甜菊醇单糖苷含量提高,总糖苷、莱包迪苷A含量及占比没有明显变化;单独导入SrUGT91D2m的转基因植株中甜菊醇单糖苷含量显著降低,而甜菊醇双糖苷含量显著增加;单独导入SrUGT76G1的转基因植株中,总糖苷含量显著提高,莱包迪苷A含量达到10%以上,比对照提高了2倍,而甜菊糖苷含量减少了一半。3个基因组合同时导入的转基因甜叶菊植株与单独导入SrUGT76G1的转基因甜叶菊植株类似,其总糖苷、莱包迪苷A含量及其占比均显著提高。这些结果为以后通过分子生物学技术来调控甜菊醇糖苷生物合成关键基因的表达,培育莱包迪苷A含量高的高品质甜叶菊新品系提供了理论依据和技术方法。

构建高效糖配体再生重组菌生物催化合成莱鲍迪苷D

利用拟南芥(Arabidopsis thaliana)蔗糖合酶AtSUS3构建活化糖配体尿苷二磷酸葡萄糖(uridine diphosphate glucose,UDPG)再生体系,与高效催化莱鲍迪苷D(rebaudioside D,RD)合成的糖基转移酶协同偶联完成RD的高效生物催化。从拟南芥cDNA克隆获得AtSUS3基因,将其装配至pET28a获得表达质粒pLW105,随后pLW105与携带糖基转移酶EUGT11基因的质粒共转化大肠杆菌BL21(DE3)构建双酶共表达工程菌。在不添加UDPG或者尿核苷二磷酸(uridine diphosphate,UDP)的条件下,以上述双酶共表达工程菌全细胞催化莱鲍迪苷A(RA)获得的底物摩尔转化率大于80%,RD产量达到930 mg/L。随后构建双酶基因串连质粒pLW108及双酶共表达大肠杆菌BL21(DE3)工程菌。用串连质粒构建的工程菌催化效果与双质粒共转化相同。采用共表达双酶工程菌的发酵破碎粗酶进行催化,结果显示以粗酶催化可简化催化体系,并可将细胞催化体系所需高质量浓度蔗糖用量降至质量浓度5 g/100 mL,同时在不添加外源UDPG的条件下实现RD的高效生物催化,RA底物摩尔转化率达到93%,RD产量约为1 051 mg/L。

脱苦甜菊糖的酶法制备

甜菊糖是一类被广泛使用的天然高倍甜味剂。本文研究了一种新的来源于Paneibacillusmacerans JFB05-01的α-环糊精葡萄糖基转移酶催化甜菊苷(St)的转糖苷反应,以此克服其后苦涩味这一致命缺点。最终优化条件为:60℃下,以水为溶剂,淀粉水解液作为糖基供体,浓度为15 mg/mL,甜菊苷浓度为10 mg/mL,加酶量为15 U/g St,3 h后可到平衡,甜菊苷的转化率可达59.2%,St-Glu 1的产率为32.4%。转苷产品经淀粉糖化酶水解0.75 h,St-Glu 1含量提高至43.1%。转苷产物的溶解度提高60倍以上,后苦涩味明显改善。