在线抗氧化分析和超滤亲和液质联用技术快速筛选桂花抗氧化及抑制酪氨酸酶的活性成分

目的:研究桂花水提物的抗氧化活性及酪氨酸酶抑制活性,并初步研究其活性化学成分。方法:以DPPH·清除能力、ABTS^(+)·清除能力和FRAP这3种抗氧化活性评价指标来衡量桂花水提物及其化合物的抗氧化能力;采用超高效液相-ABTS^(+)·-质谱(UPLC-PDA-QDa-ABTS^(+)·)在线法对桂花中的抗氧化活性成分进行定性鉴别,同时采用超滤亲和-液质联用技术(Ultra-filtration affinity-liquid chromatography spectrometry,UF-LC-MS),筛选桂花中的酪氨酸酶抑制剂。用H_(2)O_(2)致皮肤成纤维细胞氧化损伤模型,评价桂花水提物及其化合物对皮肤成纤维细胞的氧化应激保护作用。结果:桂花水提物清除DPPH·及ABTS^(+)·的半数有效浓度(EC_(50))值分别为37.66和38.32μg/mL。当桂花浓度达到2 mg/mL时,FRAP值可高达3.17。桂花水提物抑制酪氨酸酶双酚酶的EC_(50)为595.9μg/mL。通过UPLC-Triple-TOF/MS分析,初步鉴定了桂花水提物中28种化学成分。采用UPLC-PDA-QDa-ABTS^(+)·在线法及UF-LC-MS技术,快速筛选出桂花提取物中5种具有较好抗氧化作用并兼具显著酪氨酸酶结合率的化学成分,鉴定其中主要的活性成分为毛蕊花糖苷。体外抗氧化和酪氨酸酶实验,验证了毛蕊花糖苷具有显著抗氧化活性及酪氨酸酶抑制活性。毛蕊花糖苷清除DPPH·及ABTS^(+)·的EC_(50)值分别为10.27和14.96μg/mL。当毛蕊花糖苷浓度达到1 mg/mL时,FRAP值可高达4.22。毛蕊花糖苷对酪氨酸酶单酚酶的EC_(50)为477.5μg/mL,对双酚酶的抑制活性几乎没有。利用H_(2)O_(2)致皮肤成纤维细胞氧化损伤模型,进一步验证桂花提取物及毛蕊花糖苷对皮肤成纤维细胞氧化损伤具有显著保护作用。结论:桂花水提物及其主要活性成分毛蕊花糖苷具有很好的体外抗氧化能力、酪氨酸酶抑制活性及氧化应激保护能力。

超滤亲和液质联用技术筛选显齿蛇葡萄叶中酪氨酸酶抑制剂

目的采用超滤亲和-液质联用技术(ultra-filtration affinity-liquid chromatography-mass spectrometry,UF-LC-MS)结合体外酶活性实验,筛选药茶两用植物显齿蛇葡萄Ampelopsis grossedentata叶(藤茶)中的酪氨酸酶抑制剂。方法通过体外酶活实验发现藤茶具有很好的酪氨酸酶抑制活性,采用UF-LC-MS筛选并鉴定藤茶中1个主要组分对酪氨酸酶的活性具有抑制作用,并鉴定为二氢杨梅素。进一步通过体外荧光光谱、圆二色谱和分子对接技术研究了二氢杨梅素对酪氨酸酶的分子作用机制。结果发现二氢杨梅素对酪氨酸酶具有较高的抑制作用,对单酚酶及双酚酶的半数抑制浓度(median inhibition concentration,IC_(50))分别为37.73、18.87μg/mL。分子模拟结果显示,二氢杨梅素可以进入酪氨酸酶的活性中心,与氨基酸残基形成4个氢键,改变酶活性中心的构象,从而导致酪氨酸酶催化活性下降。此外,二氢杨梅素能明显抑制B16黑色瘤细胞的增殖,并且显著降低黑色素合成。结论为利用UF-LC-MS和分子对接技术筛选药用植物中酪氨酸酶抑制剂提供了参考,也为后续研究和开发藤茶及二氢杨梅素用于治疗皮肤色素沉着性疾病提供理论基础。