欧亚种葡萄花色素苷的积累及UFGT基因的RT-PCR表达分析

以欧亚种葡萄为试材,研究南方设施栽培条件下果实中花色素苷的积累与着色。结果表明,转熟期花色素苷开始积累,果实颜色由绿转红直至成熟,其积累的花色素苷以单糖苷类为主,不同于欧美杂交种,品种间花色素苷组分也存在差异。设施条件下与离体培养结果均表明外源应用ABA和鼠李糖能够促进欧亚种葡萄红地球果实花色素苷的积累,芍药色素糖苷含量增加显著,蔗糖则起抑制作用。半定量RT-PCR分析显示,葡萄糖类黄酮转移酶RGufgt基因(GenBank:DQ513314)在葡萄幼叶中表达,在绿果时不表达,果实转熟着色后即开始表达,直至果实成熟,同花色素苷积累过程完全一致。

芒果UFGT基因的克隆及表达分析

花色素苷的合成是红色芒果果实着色的主要代谢途径,类黄酮糖基转移酶（UFGT）是花色素苷合成的最后一个酶,它可以将不稳定的花色素催化成花色素苷。根据已经报道的UFGT基因的序列设计兼并引物,采用3＇RACE、5＇RACE方法,克隆得到芒果果实UFGT基因的全长c DNA序列。该基因开放阅读框为1 392 bp,编码463个氨基酸,分子量为51.15 ku。对基因组扩增得到2 770 bp长度的片段分析发现,该基因含有2个内含子,分别在501-1 095 bp、1 548-2 330 bp。通过系统发育分析发现,该基因编码的蛋白与荔枝、山竹子等热带果树具有较近的亲缘关系。对不同芒果品种的UFGT基因表达进行分析发现,红色的芒果品种中表达量较高,黄色的芒果品种中表达量较低。

刺葡萄愈伤组织UFGT基因克隆及表达分析

为从细胞水平上揭示刺葡萄3-O-类黄酮葡萄糖基转移酶(UFGT)基因调控花青素合成的功能,以刺葡萄愈伤组织为试验材料,根据刺葡萄愈伤组织转录组UFGT序列片段,利用RT-PCR结合RACE技术克隆得到VdUFGT基因,并对其进行生物信息学和表达特性分析。结果表明,VdUFGT基因cDNA和DNA开放阅读框(ORF)分别为1 371 bp和1 448 bp,包含2个外显子和1个内含子,编码456个氨基酸,为带负电荷的不稳定的亲水性蛋白,具有一个UDPGT结构域,是UDPGT超家族成员,包含UDP-黄酮糖基转移酶特征区域。由UFGT同源基因编码蛋白所构建的系统发育树,与植物进化的关系相一致,6个葡萄属植物聚为一支。RT-qPCR分析表明,刺葡萄红色愈伤组织VdUFGT转录水平极显著高于白色愈伤组织,培养25 d的2个细胞培养物差异可达79倍;在刺葡萄愈伤组织连续培养过程中,红色愈伤组织中Vd UFGT转录水平变化幅度较大,在愈伤组织快速生长中期和衰老初期分别出现峰值,而刺葡萄白色愈伤组织VdUFGT转录水平与红色愈伤组织相比变化幅度不大,且始终维持在一个较低的水平。说明VdUFGT对刺葡萄红色愈伤组织细胞培养物中的花青素生物合成有重要的调控作用,这种调控作用主要发生在刺葡萄愈伤组织细胞快速生长中期和细胞衰老初期。本研究结果为进一步阐明VdUFGT调控刺葡萄细胞花青素合成的机制奠定了理论基础。

欧李ChUFGT基因的克隆、生物信息学分析及亚细胞定位

为从分子水平上揭示欧李中3-O-类黄酮葡萄糖基转移酶(UFGT)基因的空间表达情况,以欧李叶片为试材,根据欧李的转录组序列设计特异性引物,通过PCR获得ChUFGT基因序列,并进行生物信息学分析及亚细胞定位分析。结果表明,ChUFGT基因DNA开放阅读框为1425 bp(不含终止子),相对分子质量为51.63 kD,编码475个氨基酸,其对应的蛋白质是带正电荷的稳定疏水性蛋白。与近缘物种的蛋白质序列比对分析显示,欧李、李和樱桃李的UFGT氨基酸序列相似度达到97.22%和96.62%,整个系统发育树存在两个大分支,其中ChUFGT与同科植物的亲缘关系最近,其次是与白梨、西洋梨、荔枝等其他科植物相对较近,与葡萄、刺葡萄、石榴等植物的亲缘关系最远。ChUFGT的亚细胞定位结果分析显示,在洋葱内表皮细胞的细胞核和细胞质中都表达该基因。本研究结果为进一步阐明ChUFGT调控欧李细胞花色素苷的合成机制提供了理论基础。

苹果梨果实着色相关酶基因片段克隆及表达分析

通过RT-PCR技术对苹果梨果实着色相关酶(PAL、CHI、UFGT)基因片段进行了克隆,并且采用半定量RT-PCR技术进行了3种酶基因在不同发育阶段的表达分析。结果表明:苹果梨与其他植物PAL、CHI、UFGT的相同氨基酸和相似氨基酸的百分比都约为90%,分别与鸭梨、砂梨、西洋梨氨基酸序列聚类关系最近;套袋抑制PAL、CHI、UFGT 3种酶基因的表达,去袋后,3种酶基因的表达量明显增加。

桑树类黄酮3–O–葡萄糖基转移酶基因的鉴定及主效基因功能分析

根据同源比对,从川桑(Morus notabilis)基因组数据库(morus.swu.edu.cn/morusdb/)中鉴定类黄酮3–O–葡萄糖基转移酶基因(MaUFGT)家族成员。采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析MaUFGT在桑树各组织和发育期的表达水平。随着果实发育成熟,MaUFGT1、MaUFGT2和MaUFGT3的表达模式相似,均呈上升趋势;在从顶芽依次向下不同叶位中,3个UFGT基因表达呈现先降低后升高,再降低又升高的趋势;在幼茎皮层和托叶中大量表达,幼茎表皮和木质部、叶柄中表达量较低,有的甚至不表达。MaUFGT2的表达量在3个基因中都是最高的,推测其是该基因家族的主效基因。从桑树品种‘嘉陵40’成熟果实中克隆了UFGT2基因,命名为MaUFGT2,登录号KP455729.1。其c DNA全长为1 386 bp,编码461个氨基酸,推测蛋白质分子量约为51 k D。序列比对结果发现所编码蛋白在不同物种间保守性不高。将MaUFGT2克隆到p ET-28a(+)原核表达载体后在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析显示,融合蛋白大小约为55 k D,主要以包涵体形式表达,在上清液中也有少量表达。MaUFGT2蛋白经纯化和复性后,最后通过高效液相色谱(HPLC)分析该蛋白的酶活性,结果表明,体外酶活性鉴定MaUFGT2能够催化UDP葡萄糖转移至槲皮素形成槲皮素3–β–D–葡萄糖苷,验证了其具有糖基转移酶的功能。

基于牡丹类黄酮糖基转移酶基因建立VIGS技术体系

牡丹(Paeonia suffruticosa Andrews)花色的化学基础研究较为深入,但因其无遗传转化体系,导致花色相关基因的功能验证只能利用其他植物进行旁证。利用保守区段长分别为413和418 bp的牡丹花瓣类黄酮糖基转移酶基因PsUF3GT和PsUF5GT,通过VIGS表达载体,采用二因素三水平的试验体系对目的基因进行沉默。结果表明,PsUF3GT和PsUF5GT的表达量在花斑中(盛开期花瓣,真空抽滤15 min)和非斑中(蕾期花瓣,真空抽滤10 min)分别比空载体处理的花斑中(盛开期花瓣,真空抽滤10 min)和非斑中(蕾期花瓣,真空抽滤15 min)降低了65.0%和85.0%;花斑中总花青苷含量分别降低了24.2%和28.2%,尤其是盛开期花瓣(真空抽滤15 min)处理后3G型糖苷降低了92.2%,蕾期花瓣(真空抽滤10 min)处理后3G5G型糖苷降低了54.9%。由此获得了沉默PsUF3GT和PsUF5GT的适宜体系:以盛开期或者花蕾期带花柄的花朵为材料,抽真空渗透10~15 min后,置于去离子水中暗培养1 d(8℃,湿度60%);之后转移至23~25℃、湿度60%的环境,光照培养3 d后可用于检测和分析。本研究中建立的VIGS体系可有效沉默花瓣中的内源基因,为牡丹基因功能验证及其花色形成的分子机制研究奠定了基础。