Uhrf1基因重组腺病毒载体构建及其在小鼠心肌细胞DNA损伤修复中的作用研究

目的:构建携带小鼠泛素样同源域和环指结构域1(Uhrf1)基因的重组腺病毒载体,验证Uhrf1基因在原代乳鼠心肌细胞中的表达情况,并探究其在过氧化氢(H_(2)O2)诱导的心肌细胞DNA损伤中的作用。方法:利用PCR扩增小鼠Uhrf1基因的编码序列,将其酶切后插入pADM-CMV-C-FH载体,获得重组腺病毒质粒ADM-Uhrf1。将该质粒转染至HEK293T细胞包装成重组腺病毒颗粒,数代扩增后进行腺病毒的纯化及滴度检测。分离25只1日龄ICR小鼠原代心肌细胞,分为两组,以感染复数(MOI)为50的比例分别感染ADM-Uhrf1及ADM-control(ADMCtrl),通过Western blot及免疫荧光染色验证重组腺病毒介导的UHRF1蛋白的表达,并利用H_(2)O2诱导心肌细胞DNA损伤,进而探究Uhrf1在DNA损伤修复过程中的作用。结果:通过壳蛋白免疫法检测得到的ADM-Uhrf1病毒滴度为1.8×10^(13) pfu/L。Western blot验证显示UHRF1蛋白表达水平显著升高(P<0.05),免疫荧光染色显示UHRF1主要表达在细胞核内,且Uhrf1的过表达能够显著抑制DNA损伤标志物磷酸化组蛋白H_(2)A变异体(γH_(2)AX)蛋白的表达(P<0.01)。结论:成功构建了携带小鼠Uhrf1基因的重组过表达腺病毒载体,并通过腺病毒递送系统在心肌细胞中实现了Uhrf1的过表达,且Uhrf1的过表达有效减轻了H_(2)O2诱导的心肌细胞DNA损伤。

人UHRF1基因对乳腺肿瘤细胞BT-549生长的影响

目的探讨人UHRF1(hUHRF1)基因对乳腺癌细胞BT-549生长的影响。方法将全长hUHRF1 cDNA克隆至真核表达载体pcDNA3中,通过脂质体介导办法转染入乳腺癌细胞BT-549,筛选出hUHRF1基因高表达的细胞株。采用MTT法测定hUHRF1基因转染后对细胞生长的影响。结果与BT-549母细胞和转染了pcDNA3"空"质粒的BT-549/pcDNA3对照细胞相比,hUHRF1基因高水平表达的BT-549/hUHRF1细胞生长明显加快。结论提高hUHRF1基因表达可促进乳腺癌细胞BT-549的生长,为研究hUHRF1作为乳腺癌新基因提供了基础和依据。

UHRF1基因在人卵巢癌细胞株OVCAR-3中的表达及意义

目的:探讨针对UHRF1基因的小干扰RNA(siRNA)转染人卵巢癌细胞株OVCAR-3后UHRF1表达的变化及细胞的增殖和凋亡,为UHRF1基因作为新的靶点治疗卵巢癌提供依据。方法:用siRNA基因沉默技术,将体外化学合成的针对UHRF1基因的siRNA转染至OVCAR-3细胞(转染组),并以转染阴性对照siRNA序列的细胞作为阴性对照组,未经转染的细胞作为空白组;实时荧光定量PCR和Western blot分别检测转染前后细胞UHRF1 mRNA和蛋白表达水平的变化;CCK-8实验和流式细胞术分别检测沉默UHRF1基因后对细胞增殖和凋亡的影响。结果:实时荧光定量PCR结果显示,siRNA转染后UHRF1基因在卵巢癌细胞株OVCAR-3中表达显著降低(P<0.01)。Western blot结果显示,转染组、阴性对照组和空白组细胞UHRF1蛋白相对表达量分别为0.16±0.04、0.33±0.03、0.35±0.07;转染组细胞UHRF1蛋白表达水平显著低于阴性对照组和空白组(P<0.05),而阴性对照组和空白组之间无显著差异(P>0.05)。CCK-8实验结果显示,转染后48,72,96h,转染组细胞增殖率均显著低于空白组(P<0.01)。流式细胞术结果显示,转染组、阴性对照组细胞凋亡率分别为(15.83±2.22)%、(7.46±2.93)%,差异显著(P<0.01)。结论:UHRF1基因沉默后可显著抑制卵巢癌OVCAR-3细胞UHRF1的表达,并抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。

Let-7a负性调控人肾上皮细胞293T中UHRF1基因的表达

目的:探讨人肾上皮细胞293T中let-7a对靶基因UHRF1的负性调控作用.方法:运用生物信息学技术对let-7a靶基因进行预测和分析.构建含有UHRF1 3'UTR全长的野生型(pmiR-RB-UHRF1-3'UTR-wt)和突变型荧光素酶报告质粒(pmiR-RB-UHRF1-3'UTR-mut),分别将pmiR-RB-UHRF1-3'UTR-wt,pmiR-RB-UHRF1-3'UTRmut,pmiR-RB-REPORT vector与let-7amimics或mimics control共转染293T细胞,双荧光素酶报告系统检测转染后293T细胞的荧光素酶表达水平.293T细胞分别转染let-7amimics和inhibitor,western blot和real-time RT PCR检测UHRF1基因的表达.结果:生物信息学结果显示let-7a有48个预测靶基因,包括UHRF1,HMGA2,MAPK6等,主要涉及microRNA在肿瘤、细胞周期、PI3K-AKT、p53等信号通路.其中UHRF1 3'UTR含有一个let-7a的结合位点,且在多个物种中呈高度保守.进一步双荧光素酶检测发现,共转染let-7amimics和pmiR-RBUHRF1-3'UTR-wt的293T细胞荧光素酶活性显著降低(p<0.01).Western blot和real-time RT PCR结果显示转染let-7amimics的293T细胞UHRF1表达降低,而转染let-7ainhibitor的293T细胞UHRF1表达增高.结论:人肾上皮细胞293T中let-7a能通过与UHRF13'UTR靶向结合,负性调控UHRF1的表达.

增加UHRF1的表达降低乳癌细胞的放射敏感性

为了了解基因UHRF1(ubiquitin-like,containing PHD and RING finger domains,1)基因对乳癌细胞的生长、增殖和辐射敏感性的影响,将全长UHRF1基因的cDNA克隆至真核表达载体pcDNA3中,通过脂质体介导转染入乳癌细胞MDA-MB-231,筛选出UHRF1高表达的细胞株。借助生长曲线、集落形成实验,研究基因转染细胞的生长、增殖能力;通过γ射线辐照后的集落形成实验,观察基因转染对细胞辐射敏感性的影响。实验结果显示,与MDA-MB-231母细胞和转染了pcDNA3"空"质粒的MDA-MB-231/pcDNA3细胞相比,转染有UHRF1基因的MDA-MB-231/UHRF1细胞的生长率和克隆形成率都未有明显改变,但细胞的辐射敏感性明显降低,这些结果首次揭示人类UHRF1基因的表达水平并不影响乳癌细胞MDA-MB-231的生长和增殖能力,但可以调节其辐射敏感性,具体机制有待进一步深入研究。

UHRF1基因沉默对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨沉默UHRF1基因在胰腺癌细胞进展中的影响。方法选择2018年7月-2018年12月于乐山市人民医院肝胆外科行胰十二指肠切除术的30例胰腺癌患者,切取患者非坏死胰腺癌组织及相邻的癌旁组织为研究标本。采用半定量RT-PCR和Western Blot检测标本中UHRF1的mRNA和蛋白表达水平;随后构建靶向沉默UHRF1基因的短发夹RNA(sh-RNA)质粒表达载体,并采用慢病毒感染法转染胰腺癌细胞,MTT法检测细胞增殖;Western Blot法检测UHRF1、Bax和Bcl-2蛋白水平。计量资料两组间比较采用独立样本t检验;多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。结果UHRF1基因在胰腺癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织(t=18.131,P<0.001)。与UHRF1组相比,UHRF1-shRNA组癌细胞中UHRF1蛋白水平明显下调(t=3.882,P=0.023),转染12 h及36 h后细胞增殖受到抑制(t值分别为4.365、19.042,P值分别为0.005、<0.001);UHRF1-shRNA组与癌旁组织及UHRF1组比较,促凋亡蛋白Bax表达明显增加(F=862.366,P<0.001),而抑凋亡蛋白Bcl-2水平显著降低(F=170.167,P<0.001)。结论UHRF1基因在胰腺癌组织中表达上调,UHRF1基因沉默能抑制癌组织的进展,可能与诱导肿瘤细胞凋亡相关。UHRF1基因沉默可能成为胰腺癌治疗的一个新的分子靶点。

下调UHRF1的表达在抑制肝癌进展中的作用

目的探讨UHRF1的异常表达在肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)进展中的作用机制。方法采用RT-PCR和Western blot法检测UHRF1在20例HCC标本中的m RNA和蛋白表达水平,Western blot法检测不同转移潜能的肝癌细胞Hep G2、SMMC7721、MHCC97L和HCCLM3中的UHRF1的表达水平;si RNA技术干扰HCCLM3细胞中UHRF1表达后,MTT法检测细胞增殖,Western blot法检测BAX和BCL-2表达水平的改变,流式细胞术检测HCCLM3细胞周期和细胞凋亡的变化。结果UHRF1在肺癌组织中的表达水平较癌旁组织显著上调(P<0.05),随着肝癌细胞转移潜能升高而UHRF1表达水平也依次升高(P<0.01);si RNA技术干扰HCCLM3细胞中UHRF1表达后,HCCLM3细胞生长速度明显下降(P<0.05),HCCLM3细胞的促凋亡蛋白BAX表达水平明显上升,而抑凋亡蛋白BCL-2表达水平明显下降;UHRF1-si RNA干扰HCCLM3细胞48 h时,细胞周期分布无明显影响(P>0.05);但UHRF1表达下调有促凋亡作用,与对照组相比,干扰组的细胞凋亡率显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 UHRF1基因在肝癌组织中表达上调,下调UHRF1的表达能够抑制肝癌进展,可能是通过诱导肿瘤细胞凋亡来实现的。

基于数据挖掘分析UHRF1在肺腺癌中的表达及临床意义

目的:旨在基于生物信息数据库进行数据挖掘以探索泛素样含PHD和环指域1(UHRF1)在肺腺癌中的表达情况并分析其对肺腺癌患者的预后影响。方法:使用GEPIA数据库探索UHRF1在泛癌中的表达情况。应用UALCAN数据库和Kaplan-Meier Plotter数据库分析UHRF1和肺腺癌患者的临床相关性及预后的意义。通过GSEA分析UHRF1的相关功能。在String数据库中分析与UHRF1相互作用的蛋白。运用TCIA数据库分析肺腺癌中UHRF1表达水平和免疫浸润的关系。结果:UHRF1在大部分癌症存在表达差异,肺腺癌组织中UHRF1表达水平和正常组织相比显著升高(P<0.05)。UHRF1表达量和肺癌患者的年龄(P<0.05)、性别(P<0.05)、吸烟习惯(P<0.05)、病理分期(P<0.05)显著相关。Kaplan-Meier曲线表明UHRF1高表达和不良预后相关(P<0.05)。GSEA、蛋白-蛋白相互作用和免疫浸润分析表明UHRF1可能作为一个潜在的分子生物标志物,通过影响肺腺癌细胞的增殖、迁移、DNA甲基化和肿瘤免疫浸润,从多个方面促进肺腺癌的发生发展。结论:UHRF1可能作为肺腺癌预后的生物标志物,具有重要的临床价值。

UHRF1基因沉默可促进人肺腺癌A549细胞的凋亡

目的 :探讨慢病毒介导的sh RNA干扰泛素样含PHD和环指域1[ubiquitinlike with plant homeodomain(PHD)and ringfinger domain 1,UHRF1]基因表达对人肺腺癌A549细胞凋亡的影响及其可能的作用机制。方法 :应用蛋白质印迹法从4条针对UHRF1基因的RNA干扰慢病毒载体中筛选出1条敲减效率最高的p GC-UHRF1-sh RNA-LV-GFP#1包装成慢病毒。实验设未进行感染的空白对照组、感染非特异性sh RNA的阴性对照组和感染p GC-UHRF1-sh RNA-LV-GFP#1的UHRF1 sh RNA组。慢病毒感染A549细胞后,应用RT-PCR法检测各组细胞中UHRF1 m RNA的表达水平,蛋白质印迹法检测各组细胞中UHRF1、Bax、caspase 9和Bcl-2蛋白的表达水平;FCM法检测各组细胞的凋亡情况。结果:慢病毒p GC-UHRF1-sh RNA-LV-GFP#1感染A549细胞后明显下调UHRF1 m RNA和蛋白表达水平(P值均<0.01)。UHRF1 sh RNA组A549细胞的凋亡率显著高于空白对照组和阴性对照组(P<0.01),抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平显著下调(P<0.01),而促凋亡蛋白Bax和caspase 9的表达水平显著上调(P值均<0.01)。结论 :慢病毒介导的sh RNA沉默UHRF1基因表达可促进人肺腺癌A549细胞的凋亡,其作用可能与上调Bax、caspase 9蛋白表达和下调Bcl-2蛋白表达有关。

RNA干扰抑制UHRF1基因表达对食管癌细胞放射增敏作用的研究

目的研究RNA干扰抑制UHRF1表达对食管癌细胞系（TE-1）放射敏感性的影响及作用机制。方法以慢病毒感染方法将UHRF1基因的短发夹状RNA（shRNA）转入TE-1细胞，并分为未转染组、转染NC—shRNA组、转染UHRF1-shRNA组，前二者为对照组。采用RT—PCR和蛋白印记法检测转染前后细胞UHRF，的mRNA和蛋白表达，成克隆法、流式细胞术及蛋白印记法检测转染UHRF1-shRNA联合x线照射对TE-1细胞放射敏感性、周期、凋亡及DNA损伤标识蛋白1-H2AX的影响。结果转染UHRF1-shRNA后TE-1细胞UHRF1的mRNA和蛋白表达受抑（0．11、0．96、0．98，F=124．21，P=0．000；0．10、0．89、0．94，F=125．25，P=0．000）。X线照射后转染UHRF1-shRNA组放射增敏比分别为1．53（D。值比）和1．95（Dq值比）。x线照射可引起TE-1细胞G2＋M期阻滞、凋亡率和γ—H2 AX表达增加，与对照组相比转染UHRF1-shRNA组照后24的G：＋M期阻滞显著降低（F=500．15，P=0．000）、凋亡率和γ-H2AX残存量明显升高（F=100．10、61．00，P=0．000、0．000）。结论RNA干扰可有效抑制TE-1细胞UHRF，表达，增强细胞放射敏感性，其增敏机制与周期调控、凋亡及DNA损伤修复有关。

UHRF1基因沉默对逆转人肺腺癌A549细胞顺铂耐药性的影响

目的:检测泛素样含PHD和环指域1(ubiquitin-like with PHD and ringfinger domain 1,UHRF1)基因在人肺腺癌顺铂(cisplatin,DDP)耐药细胞株A549/DDP及其亲本细胞株A549中的表达差异,并探讨沉默UHRF1基因对逆转A549/DDP细胞对DDP耐药性的影响。方法:采用半定量RT-PCR和蛋白质印迹法检测UHRF1 m RNA和蛋白在A549及A549/DDP细胞中的表达差异。随后构建靶向沉默UHRF1基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,sh RNA)质粒表达载体,并采用慢病毒感染法感染至A549/DDP细胞,同时设未进行感染的空白对照组和感染非特异性sh RNA的阴性对照组。采用蛋白质印迹法检测各组细胞中UHRF1蛋白的表达水平。采用MTT法检测各组细胞在DDP作用下的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)。采用FCM法检测细胞凋亡率。采用蛋白质印迹法检测凋亡调节因子Bcl-2和Bax的表达情况。结果:UHRF1 m RNA和蛋白在A549/DDP细胞中的表达水平显著高于亲代A549细胞(P<0.01)。靶向UHRF1基因的sh RNA明显下调A549/DDP细胞中UHRF1蛋白的表达水平(P<0.01)。在不同浓度DDP作用24 h后,UHRF1-sh RNA组A549/DDP细胞的IC50值明显低于空白对照组和阴性对照组,对DDP的敏感性显著提高(P值均<0.01)。DDP(6 mg/L)作用24 h后,UHRF1-sh RNA组细胞的凋亡率及促凋亡蛋白Bax的表达水平较空白对照组和阴性对照组明显增高,而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平则明显下调(P值均<0.01)。结论 :UHRF1基因在人耐药肺腺癌细胞中呈现高表达,提示UHRF1参与肺腺癌耐药的形成;UHRF1-sh RNA可特异性下调UHRF1的表达,逆转A549/DDP细胞对DDP的耐药性,并通过调节凋亡相关基因的表达促进其凋亡。UHRF1基因可能成为逆转肺癌耐药性的一个新的分子靶点。

辐射敏感性新基因UHRF1真核表达载体的构建及鉴定

目的构建UHRF1的真核表达载体,并验证其在乳腺癌细胞MDA-MB-231中的表达。方法采用RT-PCR方法,从乳腺癌细胞MCF-7的总cDNA中扩增出2.3kb的UHRF1基因的cDNA片段,经限制性内切酶KpnⅠ与XhoⅠ双酶切,定向克隆到真核表达载体pcDNA3中,构建重组质粒pcDNA3(+)-UHRF1,利用限制性内切酶双酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;构建成功的重组质粒,经脂质体Lipofactamin2000介导转染MDA-MB-231细胞,G418筛选阳性克隆,以RT-PCR和Western blot检测UHRF1的mRNA和蛋白的表达。结果获得全长约为2.3kb的UHRF1基因片段;重组质粒经限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ酶切、电泳后显示2.3kb的UHRF1目的片段和5.4kb的pcDNA3载体片段,即UHRF1基因的cDNA已正确克隆到真核细胞表达载体pcDNA3中;UHRF1转染乳腺癌MDA-MB-231细胞后的RT-PCR和Western blot的结果显示:UHRF1的mRNA和蛋白水平均呈现高表达。结论成功构建UHRF1基因的真核表达载体,为进一步研究该基因的功能奠定基础。

表观遗传调节剂UHRF1在胰腺癌中的表达及其临床意义

目的:基于生物信息学进行数据挖掘以探讨UHRF1在胰腺癌中的表达情况及对胰腺癌患者预后的影响。方法:使用GEPIA数据库探索UHRF1在泛癌中的表达模式。应用Kaplan-Meier Plotter分析UHRF1对胰腺癌患者预后的意义。使用UCGA Xena制作热图分析UHRF1的表达水平、甲基化状态和拷贝数变异对胰腺癌患者预后的影响。筛选TCGA数据库和GEO数据库(GSE43795数据集)胰腺癌中UHRF1共表达基因,并应用Metascape进行基因功能富集分析。结果:UHRF1在大部分癌症中差异表达;和正常胰腺组织相比,胰腺癌组织UHRF1表达量显著升高(P<0.01)。Kaplan-Meier Plotter数据平台显示UHRF1高表达显著影响胰腺癌患者预后,其中高、低表达组中位生存期分别为16.6个月和23.17个月(HR=2.03,95%可信区间1.34~3.06,P=0.000 58)。使用UCGA Xena平台对来自TCGA数据库的178个胰腺癌数据进行分析显示,UHRF1 mRNA表达水平和胰腺癌患者预后相关,但甲基化状态以及拷贝数变异和胰腺癌患者的总生存率没有明显相关性。通过分析得出UHRF1与KIF11、KIF23、RRM2、ERCC6L和MELK等基因具有共表达关系,并且富集分析显示UHRF1共表达基因与细胞核分裂以及细胞周期相变等密切相关。在HPA数据库中分析胰腺肿瘤组织与正常组织UHRF1的免疫组化染色结果,显示UHRF1蛋白在正常胰腺组织中未检测到,而在胰腺癌组织中高表达。结论:胰腺癌组织中UHRF1基因表达水平显著上调,且UHRF1过表达对胰腺癌患者预后不利,UHRF1可能通过参与细胞核分裂以及细胞周期等过程实现对胰腺癌的影响。UHRF1可能作为胰腺癌预后的重要预测指标,并有潜力成为胰腺癌治疗的靶标。

UHRF1基因在甲基化调控与血管新生中的作用

近年来大量研究证实泛素样含植物同源结构域和环指结构域1(ubiquitin-like with PHD and RING finger domains 1,UHRFl)是一种与肿瘤发生相关的核蛋白基因,在表观遗传修饰过程中具有重要的调控作用,尤其是在DNA甲基化与组蛋白甲基化的调控方面。UHRF1由于其特有的结构域,在细胞生物学功能调控中起到非常重要的作用,如细胞增殖、周期和凋亡等。另外,在多种肿瘤组织和细胞中异常高表达的UHRF1可能与肿瘤血管新生密切相关。本文主要综述UHRF1对DNA甲基化及组蛋白甲基化的调控作用,并探讨了UHRF1在血管新生过程中可能发挥的表观遗传学调控作用。