心血管疾病基因治疗的基础研究Ⅱ．Pro－UK和t－pA基因的体外表达

构建了带有人的全长Ｐｒｏ－ＵＫ或ｔ－ｐＡ基因ｃＤＮＡ的逆转录病毒质粒ｐＮ２－ＣＭＶ－ＵＫ或ｐＮ２－ＣＭＶ－ｔＰＡ。重组质粒转染包装细胞ＰＡ３ｌ７后获得含假病毒的培养上清。用假病毒上清感染培养的血管平滑肌细胞（ＶｓＭＣ），经Ｇ４ｌ８筛选得到抗性集落。Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析表明，Ｐｒｏ－ＵＫ或ｔ－ｐＡ基因已整合到宿主细胞染色体。在转染的ＶＳＭＣ中，Ｐｒｏ－ＵＫ和ｔ－ｐＡ的含量分别为２６５ｎｇ／１０７细胞／２４小时和５．６ｎｇ／１０７细胞／２４小时。溶圈法测定结果证明，Ｐｒｏ－ＵＫ基因导入细胞后可以表达出有生物活性的尿激酶原。

非洲猪瘟病毒DP96R蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

本研究旨在采用原核表达系统表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)Georgia 2007/1毒株毒力基因UK,获得重组蛋白(DP96R),进一步制备并鉴定DP96R重组蛋白的多克隆抗体。首先构建原核重组表达质粒pET-28a-UK并转化BL21感受态细胞,在16℃、0.4 mmol/L IPTG条件下诱导10 h后,检测到目的蛋白以可溶性表达为主,蛋白分子量约为15 kDa。然后采用纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗DP96R蛋白多克隆抗体。ELISA结果表明制备的多抗具有良好反应性,Western blot和免疫荧光实验(immunofluorescence assay,IFA)表明制备的多抗能特异性识别真核表达的DP96R蛋白。DP96R重组蛋白及多克隆抗体的制备为进一步研究DP96R蛋白的生物学功能以及建立ASFV毒株鉴别诊断的血清学检测方法奠定了基础。

心血管疾病基因治疗的基础研究Ⅳ．外源基因的在体表达

将ｐＮ２－ＬａｃＺ和ｐＮ２－ＣＭＶ－ＵＫ质粒直接注射到Ｗｉｓｔａｒ大鼠股四头肌，可以在肌肉中检测到这两种基因的表达产物。注射ｐＮ２－ＬａｃＺ质粒后７天，β－半乳糖苷酶的表达量最高，可达２．４８×１０－４Ｕ／ｇ组织，并且可持续表达３周以上。组织化学染色表明部分肌细胞内有ＬａｃＺ基因表达。当用脂质体介导时，注射含３０μｇ质粒的脂质体─ＤＮＡ复合物，β－半乳糖苷酶的活性同直接注射８０μｇ质粒时的活性无差别，直接注射ｐＮ２－ＣＭＶ－ＵＫ质粒后７天，单链尿激酶原含量最高，可达５５０ｎｇ／ｇ组织。基因注射后３个月仍可检测到单链尿激酶原。

携带人尿激酶原cDNA的重组腺病毒载体的构建及其在体内的表达

目的 构建表达人尿激酶原的重组腺病毒载体,为临床基因治疗提供实验依据。方法 采用亚克隆获得的pCA14-pro-UK重组质粒与质粒pJM17共转染培养的293细胞,经同源重组,得到含有pro-UKcDNA的重组腺病毒。扩增纯化后,局部转染经球囊损伤后的兔股动脉。7d后,分别收集转染的血管段和对照血管段,以Western印迹和免疫组化检测表达。结果 (1)经PCR扩增及体外感染A549细胞结果表明,获得了具有生物活性的含人pro-UKcDNA的重组腺病毒;(2)重组腺病毒的滴度为1×109噬菌斑形成单位/ml(PFU/ml);(3)免疫组化及Western印迹分析显示:重组腺病毒能在损伤的兔股动脉内膜表达尿激酶原。结论 构建得到的携带人尿激酶原cDNA的重组腺病毒能在损伤血管部位表达。

Pro-UK基因抑制静脉移植物细胞增生的实验研究

目的：探讨ＰｒｏＵＫ 基因对静脉桥移植物细胞增生的影响。方法：３００ ～３５０ｇ Ｗｉｓｔａｒ 大鼠４２ 只，取下大鼠颈静脉，两端阻断后，用含Ａｄｖ５ＣＭＶ 质粒（ 对照组，２１ 只） 或含Ａｄｖ５ＣＭＶＰｒｏＵＫ 质粒（ 治疗组，２１ 只） 的溶液扩张静脉，使溶液在静脉腔内滞留３０ 分钟，然后置于同一大鼠的颈总动脉。术后２８ 天，取静脉移植物行尿激酶原活性测定，观察ＰｒｏＵＫ 基因的表达。行３ＨＴＤＲ 掺入量测定和病理分析，观察静脉桥管壁增厚情况。结果：术后２８ 天，治疗组可测到较高水平的ＰｒｏＵＫ 表达（２６５ｉｕｇｔｉｓｓｕｅ） ，对照组未测到ＰｒｏＵＫ 活性。虽然两组的管壁均有不同程度的增厚，但治疗组管壁增厚明显小于对照组（ Ｐ＜ ０ ．０１） ，而管腔面积明显大于对照组（ Ｐ＜ ０ ．０１） 。３ＨＴＤＲ 掺入量比对照组低。治疗组１０ 条静脉桥全部畅通，而对照组１０ 条静脉桥有２ 条发生闭塞。结论：用静脉桥局部直接转基因的方法将腺病毒载体介导的ＰｒｏＵＫ基因转入静脉桥可明显抑制细胞增生，是提高静脉桥通畅率的一个有效方法。