伪狂犬病病毒UL24基因的原核表达及抗UL24蛋白抗体的制备

为了给伪狂犬病病毒(PrV)UL24蛋白的细胞定位和功能研究提供参考依据,据GenBank公布的PrVUL24基因序列(登录号NC006151)设计1对引物,以质粒pUL24-GFP为模板,用PCR方法扩增出部分缺失的基因片段mUL24(modified UL24)。将mUL24片段定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建融合表达载体pET-UL24。阳性质粒转化宿主菌E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导,重组蛋白(His)6-UL24以包涵体的形式获得表达。用纯化后的pET-UL24融合蛋白免疫家兔,ELISA分析表明,在血清效价达到1∶2 560以上,Western-blot分析制备的抗体可以和pET-UL24表达产物发生反应,具有良好的免疫特异性。

鸭瘟病毒UL24基因的分子特征分析

根据本实验室获得的鸭瘟病毒的一段基因序列设计引物，利用PCR扩增UL24基因并克隆到pMD18-T载体，阳性重组质粒进行酶切鉴定、测序验证与生物信息学分析。结果显示，获得的UL24基因全长1230bp，编码409个氨基酸；与其他26株疱疹病毒科中α-疱疹病毒亚科的UL24基因的相似性较β和γ亚科高，其中与α亚科禽疱疹病毒属中的GaHV-3相似性最大（34．7％）；遗传进化树显示，该基因编码的蛋白与火鸡疱疹病毒的UL24蛋白的亲缘性最近。该蛋白是一种保守但不含信号肽的外膜蛋白，具有5个潜在的N-糖基化位点和19个磷酸化位点；编码的氨基酸Ala，Apn，Glu，Phe，Leu，Arg，Thr，Val具有一定的偏嗜性。二级结构分析显示，α螺旋和无规卷曲含量高，均达46．94％，而口折叠仅占6．11％；同源建模比对，未发现与之匹配的三级结构；预测的抗原表位主要位于肽链第36～48、241～323、344～379位区段。

鸭肠炎病毒UL24/C基因酵母双杂交诱饵载体构建及鉴定

为构建DEV UL24/C蛋白的酵母双杂交的诱饵载体,本研究以DEV CHv株基因组DNA为模板,经一步法克隆构建pGBKT7-UL24/C诱饵质粒,质粒转化酵母菌株后进行自激活活性检测、免疫印迹检测和毒性检测。结果显示,诱饵质粒pGBKT7-UL24/C插入片段大小为510 bp,且未发生基因突变;pGBKT7-UL24/C质粒转化Y2HGold菌株后的自激活检测显示诱饵菌株无自激活活性,免疫印迹检测表明该诱饵菌株成功表达DEV UL24/C蛋白,毒性检测表明该诱饵蛋白对宿主菌Y2HGold无毒性作用。综上表明,未研究正确构建了UL24/C基因酵母双杂交诱饵载体Y2HGold(pGBKT7-UL24/C),为筛选与DEV UL24蛋白相互作用蛋白、探究DEV UL24蛋白功能及分子机制奠定了基础。

疱疹病毒UL24基因及其编码蛋白的研究进展

对疱疹病毒UL24基因的序列特点、编码蛋白的特点、基本功能以及UL24基因编码蛋白与疱疹病毒调节蛋白ICP27、细胞周期蛋白B/Cdc2复合体、UL12蛋白和胸腺激酶的相互作用进行了总结。旨在阐明UL24蛋白在病毒毒力、病毒复制、核仁素的散布和细胞膜融合方面发挥着重要作用;疱疹病毒UL24基因属于晚期基因,是疱疹病毒基因组特定长区中的一个核心基因。

Ⅰ型马立克病毒UL24蛋白的原核表达及其亚细胞定位的研究

为研究Ⅰ型马立克病毒（MDV）UL24蛋白的亚细胞定位,以MDV GX0101为模板,PCR扩增UL24基因全长,分别克隆到原核表达载体pGEX-6P-1、pET-32a（＋）和真核表达载体pEGFP-C1中。将原核表达重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）中表达,并进行纯化和鉴定。用纯化蛋白免疫Balb/c小鼠,制备并鉴定抗UL24蛋白的多克隆抗体。通过间接免疫荧光试验（IFA）检测感染GX0101的鸡胚成纤维细胞（CEF）中的UL24蛋白。同时,将真核表达重组质粒pEGFP-C1-UL24转染CEF细胞,通过激光共聚焦显微镜观察UL24蛋白在CEF中的亚细胞定位。结果显示Ⅰ型MDV的UL24基因在原核表达载体中能够正确表达,免疫小鼠后获得抗UL24蛋白的多克隆抗体。该抗体可特异性识别MDV UL24蛋白,且MDV UL24蛋白在CEF的细胞质和细胞核中定位,以上研究结果为进一步研究MDV UL24基因的功能奠定基础。