HSV-1 UL30基因cDNA的克隆及筛选有效siRNA的融合载体构建

目的:克隆HSV-1 UL30 cDNA并测序,构建pEGFP-N1-Fi融合表达载体,为靶向UL30基因的siRNA的设计和筛选奠定基础。方法:从感染HSV-1F株的病变VERO细胞提取总RNA,二次PCR扩增出UL30 cDNA并克隆至pEGFP-N1质粒,测序鉴定序列;将UL30 cDNA4个小片段亚克隆至pEGFP-N1形成pEGFP-N1-Fi融合表达质粒,转染VERO细胞,荧光显微镜观察融合蛋白表达情况。结果:成功克隆出UL30 cDNA,序列对比显示与基因库中的HSV-1F株UL30序列同源性为99.4%;成功构建pEGFP-N1-Fi融合表达载体并实现Fi-EGFP融合蛋白的表达。结论:成功克隆出UL30 cDNA,成功构建pEGFP-N1-Fi融合表达载体,为靶向UL30基因的siRNA的设计和筛选奠定基础。

siRNA干扰HSV-1 UL30 DNA聚合酶基因的研究

目的:筛选高效沉默HSV-1UL30基因的siRNA,研究siRNA沉默UL30基因后对HSV-1繁殖的影响。方法:设计并化学合成12对靶向UL30基因的siRNA,与pEGFP-N1-Fi融合表达质粒共转染VERO细胞,流式细胞术筛选高效抑制Fi-EGFP融合蛋白的siRNA,实时荧光定量PCR检测siRNA对感染细胞内UL30mRNA表达的抑制效果,CPE法和空斑减数实验评价siRNA对HSV-1繁殖的抑制效果。结果:共转染实验筛选出高效抑制Fi-EGFP融合蛋白的siRNA4、siRNA10及siRNA8,这3对siRNA均能显著降低感染细胞内UL30mRNA的表达水平及病变细胞释放到培养上清的子代病毒滴度,siRNA4和siRNA10在感染后36h对HSV-1的繁殖有明显的抑制效果,其病斑分别比对照组减少61.17%、51.46%(P<0.05),siRNA4、siRNA10及siRNA8组最终形成的空斑直径分别比对照组减小29.94%、23.49%、21.69%(P<0.01)。结论:筛选到高效抑制UL30的3对siRNAs,siRNA4及siRNA10在病斑形成早期对HSV-1的繁殖有明显的抑制效果,说明siRNA4、siRNA10及siRNA8均能延缓病斑的扩大和病斑数目的增长,对病毒的繁殖有一定的抑制效果。

鸭瘟病毒SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的建立

为建立鸭瘟病毒(DPV)快速、敏感的检测方法,本研究利用PCR技术扩增出DPV UL30基因中510bp的保守序列,并克隆到p MD18-T载体中作为标准品制作标准曲线,建立了DPV的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达5×101拷贝,与鸭细小病毒、鸭圆环病毒、小鹅瘟病毒、鸭肝炎病毒、鸭H9亚型流感病毒和鸭副粘病毒均不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性。结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床DPV的检测。

皱瘤海鞘乙醇提取物对HSV-2基因复制的影响

目的研究皱瘤海鞘乙醇提取物对HSV-2DNA复制的影响;方法以Vero细胞为模型,应用CPE法,MTT法、real-time PCR与反向PCR检测皱瘤海鞘乙醇提取物对HSV-2DNA合成的抑制作用。结果皱瘤海鞘乙醇提取物显著抑制HSV-2所致的CPE;皱瘤海鞘乙醇提取物在HSV-2生物合成早期(-2,0,2h)时干预,对HSV-2的生物合成抑制效果较好,病毒抑制率达65%以上;皱瘤海鞘乙醇提取物能够显著抑制HSV-2DNA拷贝数,与病毒对照组比较具有显著差异(P<0.01),并能下调HSV-2DNA聚合酶UL30基因的表达。结论皱瘤海鞘对HSV-2DNA复制具有抑制作用,其作用靶点之一是HSV-2DNA聚合酶UL30基因。