竹节香附素A通过ULK1/Atg13及ROS途径调控肝癌细胞自噬的作用研究

目的探讨竹节香附素A通过自噬激活激酶1(ULK1)/自噬相关蛋白13(Atg13)及活性氧(ROS)途径调控肝癌细胞自噬的作用。方法2019年8—9月于开滦总医院实验室进行实验,设肝癌HepG2细胞组、5-氟尿嘧啶组(80 mg/μl)、竹节香附素A低剂量组(100 mg/μl)、竹节香附素A高剂量组(200 mg/μl),4组每孔设6个平行样,培养72 h,培养结束后,测定细胞存活率、自噬、凋亡率,检测ULK1、Atg13 mRNA和蛋白水平,2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)测定ROS水平。结果与肝癌HepG2细胞组比较,5-氟尿嘧啶组及竹节香附素A低、高剂量组HepG2细胞OD值、存活率降低(P<0.01),自噬小体、HepG2细胞凋亡率、ULK1、Atg13 mRNA和蛋白表达、ROS水平升高(P<0.01);与5-氟尿嘧啶组比较,竹节香附素A低、高剂量组细胞OD值、存活率升高(t/P=21.214/0.000、19.547/0.000、18.547/0.000、25.478/0.000),自噬小体、凋亡率、ULK1、Atg13 mRNA和蛋白表达水平、ROS水平降低(t/P=16.325/0.000、22.547/0.000、9.874/0.000、16.589/0.000、13.654/0.000、14.654/0.000、16.589/0.000、21.247/0.000、21.687/0.000、18.324/0.000、18.541/0.000、19.587/0.000、19.654/0.000、24.052/0.000);与竹节香附素A低剂量组比较,竹节香附素A高剂量组细胞OD值、存活率降低(t/P=16.547/0.000、23.547/0.000),自噬小体、凋亡率、ULK1、Atg13 mRNA和蛋白表达水平、ROS水平升高(t/P=15.696/0.000、10.654/0.000、14.697/0.000、18.324/0.000、17.024/0.000、19.634/0.000、18.547/0.000)。结论竹节香附素A能明显抑制肝癌细胞增殖,促进肝癌细胞自噬及凋亡;其机制与竹节香附素A激活ULK1/Atg13及ROS通路有关。

罗氟司特通过mTOR/ULK1/Atg13通路改善支气管哮喘小鼠气道炎症反应的研究

目的探讨罗氟司特对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/自噬激活激酶1(ULK1)/自噬相关蛋白13(Atg13)通路的调控作用,以及对支气管哮喘(BA)小鼠气道炎症反应的影响。方法将60只小鼠随机分为正常对照组、模型组、罗氟司特组(1.0 mg/kg)、自噬抑制剂(3-甲基腺嘌呤,3MA)组(10.0 mg/kg)、自噬激活剂[mTOR抑制剂雷帕霉素,1.0 mg/kg]组,罗氟司特+雷帕霉素组(1.0 mg/kg+1.0 mg/kg),每组10只。用卵清蛋白致敏法诱导建立小鼠BA模型,各组小鼠均给药4周。末次给药结束后,应用动物肺功能仪检测小鼠肺功能;取支气管肺泡灌洗液(BALF)检测炎症细胞数目;酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测BALF中γ-干扰素(INF-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;苏木精-伊红(HE)及过碘酸-雪夫(PAS)染色检测肺组织结构变化及气道杯状细胞化生情况;透射电镜下观察自噬泡形成情况;TUNEL法检测气道上皮细胞凋亡情况;蛋白质印迹法(Western blot)检测Atg13、磷酸化Atg13(p-Atg13)、mTOR、磷酸化mTOR(p-mTOR)、ULK1特定位点Ser757蛋白(ULK1 Ser757)及其磷酸化蛋白(p-ULKl Ser757)、自噬标记蛋白微管相关蛋白轻链3B(LC3B)、自噬相关蛋白(Beclin1)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、白细胞介素-33(IL-33)、黏液高分泌性标志蛋白(黏蛋白MUC5AC)表达水平。结果与正常对照组相比,模型组小鼠肺功能下降,肺组织炎症细胞聚集及杯状细胞化生症状严重,mTOR/ULK1/Atg13通路磷酸化蛋白表达降低,自噬相关蛋白表达水平、炎症因子水平及凋亡率升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,罗氟司特组及3MA组小鼠气道上皮细胞自噬及凋亡减少,mTOR/ULK1/Atg13通路磷酸化蛋白表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。雷帕霉素可逆转罗氟司特的上述缓解作用(P<0.05)。结论罗氟司特可通过促进mTOR/ULK1/Atg13通路磷酸化活化,阻断自噬,抑制气道炎症及上皮细胞凋亡的发生,进而缓解BA病理症状。