青蒿琥酯调节AMPK/mTOR/ULK1信号通路对肾母细胞瘤细胞增殖、凋亡和自噬的影响

目的探讨青蒿琥酯对肾母细胞瘤细胞增殖、凋亡和自噬的作用及其分子机制。方法体外培养人肾母细胞瘤细胞株SK-NEP-1并以0、12.5、25.0、50.0、100.0、150.0μmol/L浓度的青蒿琥酯处理,采用CCK-8法测定各组细胞活力并筛选出青蒿琥酯最佳作用浓度。将SK-NEP-1细胞随机分为对照组、青蒿琥酯(100.0μmol/L)组、AMPK抑制剂Dorsomorphin(10.0μmol/L)组、青蒿琥酯(100.0μmol/L)+Dorsomorphin(10.0μmol/L)组,以青蒿琥酯和Dorsomorphin单独或联合处理各组细胞后,采用CCK-8法检测各组细胞活力,采用平板克隆形成实验检测各组细胞的集落形成情况;采用流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况;采用MDC荧光染色法检测各组细胞的自噬情况;采用蛋白免疫印迹法检测各组细胞中凋亡相关蛋白[B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、cleaved多聚ADP核糖聚合酶(PARP)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)]、自噬相关蛋白[轻链3(LC3)Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin-1]及AMPK/mTOR/ULK1信号通路相关蛋白的表达情况。结果不同浓度青蒿琥酯均可抑制SK-NEP-1细胞的活力(均P<0.05),且随浓度升高其抑制作用增强。用100.0μmol/L青蒿琥酯和10.0μmol/L Dorsomorphin分别处理SK-NEP-1细胞后,与对照组相比,青蒿琥酯组细胞的凋亡率、自噬空泡相对量及Bax、cleaved PARP、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1蛋白表达水平均升高(均P<0.05),细胞活力、集落形成率及Bcl-2、p-mTOR/mTOR蛋白表达水平均降低(均P<0.05);Dorsomorphin组细胞凋亡率、自噬空泡相对量及Bax、cleaved PARP、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1蛋白表达水平均降低(均P<0.05),细胞活力、集落形成率及Bcl-2、p-mTOR/mTOR蛋白表达水平均升高(均P<0.05)。青蒿琥酯和Dorsomorphin联合干预SK-NEP-1细胞逆转了青蒿琥酯的抗肿瘤作用。结论青蒿琥酯可能通过激活AMPK/mTOR/ULK1信号通路增强肾母细胞瘤细胞自噬,进而抑制其增殖并促进其凋亡。

ULK1在炎症性疾病中的研究进展

UNC-51样激酶1(ULK1)是参与调节自噬启动的重要因子,ULK1通过自噬和线粒体氧化应激调节炎症细胞因子,参与了多种疾病的病理过程。ULK1及其复合体受雷帕霉素(mTOR)和AMP活化蛋白激酶(AMPK)调节启动自噬,从而对多种炎症性疾病产生不同影响。而在炎症性疾病中,线粒体氧化应激可使ULK1入核加速细胞凋亡。因此,ULK1在炎症性疾病中发挥不同的重要作用。例如,ULK1在哮喘中启动气道上皮细胞线粒体的自噬,在急性肝衰竭中参与线粒体氧化应激,在动脉粥样硬化中影响相关炎症因子,在糖尿病中调节自噬。本文从ULK1的生物学功能、在炎症性疾病中的影响和靶向药物的研究进展进行综述。

补肾健脾法对OP大鼠肌骨中ULK1/FUNDC1介导的线粒体自噬的影响

目的 探究补肾健脾法对骨质疏松(osteoporosis, OP)大鼠肌骨中ULK1/FUNDC1介导的线粒体自噬的影响。方法 72只2月龄雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、补肾组、健脾组、补肾健脾组、西药组(福善美),每组12只,模型组及各个用药组采用尾部悬吊法进行造模,造模时间为5周。正常组与模型组予以超纯水灌胃,其余各组予以相应药物进行灌胃。造模结束后行腹主动脉采血,酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清碱性磷酸酶(ALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)含量;计算机微断层扫描(Micro-CT)检测大鼠左侧股骨远端形态学变化;双能X线行股骨骨密度(bone mineral density, BMD)检测;马松(Masson)染色观察腓肠肌病理变化;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测股骨、腓肠肌中线粒体蛋白ULK1、FUNDC1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达。结果 与正常组相较,模型组ALP(P<0.01)降低、TRACP(P<0.01)升高,骨小梁面积、BMD(P<0.01)均下降,提示造模成功。Masson染色提示在中医不同治法干预下腓肠肌组织纤维化程度得到缓解。Western blot结果显示,在中医不同治法干预下与模型组股骨相比ULK1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、FUNDC1表达降低(P<0.05),线粒体自噬水平降低;与模型组腓肠肌相比ULK1、FUNDC1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达升高(P<0.05),线粒体自噬水平升高。结论 补肾健脾中医治法对于OP模型大鼠的治疗效果可能是通过ULK1/FUNDC1通路调控线粒体自噬发挥作用,综合来看补肾健脾法效果较优。

有氧运动通过AMPK/ULK1/Beclin1通路调节模拟失重导致的心脏功能变化的研究

目的探讨模拟航天飞行失重引起心肌损伤以及有氧运动干预促进大鼠心肌恢复的可能机制。方法8周龄雄性SD大鼠40只,体重180~210 g,随机分为对照组和实验组,对照组随机分为对照组C1和对照组C2,实验组随机分为悬吊组T1、有氧运动组A和自然恢复组R,每组8只;采用电子天平称量大鼠体重相关指标;采用超声心动图和离体心脏灌流检测各组大鼠心脏功能指标;采用Western Blot法检测各组大鼠心肌组织中AMPK/ULK1/Beclin1通路相关蛋白的表达。结果(1)相较于对照组C1,悬吊组T1体重无显著性差异(P>0.05),比目鱼肌的湿重、比目鱼肌湿重体重比和心脏重量均显著下降(P<0.01)。(2)尾部悬吊4周和有氧运动4周后,心脏功能相关指标发生显著性变化,悬吊组T1AMPK和p-ULK1的表达水平显著上升(P<0.01),p-AMPK的表达量显著上升(P<0.05)。有氧运动4周后,相较于对照组C2,自然恢复组R的AMPK和ULK1的表达量显著上升(P<0.05);有氧运动组A的p-AMPK的表达量显著下降(P<0.05),p-ULK1的表达量显著下降(P<0.01)。相较于自然恢复组R,对照组C2的心肌蛋白AMPK的表达量显著下降(P<0.05),ULK1的表达量显著下降(P<0.01);有氧运动组A的AMPK、ULK1的表达量显著下降(P<0.01);p-ULK1的表达量显著下降(P<0.05)。结论(1)尾部悬吊4周后,发现大鼠的比目鱼肌湿重、以及湿重体重比显著降低,心脏的重量和心脏功能相关指标也显著降低,AMPK、p-AMPK、ULK1、p-ULK1、Beclin1表达量上升;(2)有氧运动4周后,发现尾部悬吊大鼠的心肌形态,心肌超微结构和心脏功能相关指标上升,心脏功能得到一定的改善,AMPK、p-AMPK、ULK1、p-ULK1、Beclin1表达量下降;(3)心脏功能的损伤和改善与通过AMPK/ULK1/Beclin1通路调控相关蛋白AMPK、p-AMPK、ULK1、p-ULK1、Beclin1表达有关。

归芪益元膏联合顺铂调节AMPK/ULK1信号通路对Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤组织的影响

目的 基于AMPK/ULK1信号通路观察归芪益元膏联合顺铂对Lewis肺癌荷瘤小鼠的抑瘤作用及作用机制。方法 小鼠右侧腋下接种Lewis肺癌细胞建立皮下肿瘤模型。将小鼠随机分为空白组、模型组、顺铂组和中药高、中、低剂量+顺铂组,每组10只,顺铂组腹腔注射顺铂5 mg/kg(每7 d一次),中药高、中、低剂量+顺铂组在顺铂组基础上分别予归芪益元膏7.0、3.5、1.75 g/kg灌胃,每日1次,连续14 d。HE染色观察小鼠肿瘤组织形态,免疫组化测定肿瘤组织p-AMPK、p-ULK1蛋白表达,透射电镜观测肿瘤组织自噬小体数量,RT-PCR测定小鼠肿瘤组织p62、Beclin-l、Atg5、LC3 mRNA表达,Western blot检测肿瘤组织Beclin-1、p62、Atg5、LC3和AMPK/ULK1信号通路蛋白表达。结果 与模型组比较,各给药组小鼠瘤质量明显降低(P<0.05);肿瘤组织出现片状坏死区域且自噬小体数量增加,Beclin-l、Atg5、LC3 mRNA表达升高,Beclin-1、Atg5、LC3Ⅱ/Ⅰ、AMPK、p-AMPK、ULK1、p-ULK1蛋白表达升高,p62 mRNA和蛋白表达降低(P<0.05)。与顺铂组比较,中药高、中剂量+顺铂组小鼠瘤质量降低(P<0.05),抑瘤率增加;中药高、中、低剂量+顺铂组小鼠肿瘤组织ULK1蛋白和Atg5 mRNA表达明显升高(P<0.05);中药高、中剂量+顺铂组Beclin-1、LC3 mRNA表达明显升高(P<0.05),Atg5、LC3Ⅱ/Ⅰ、AMPK、p-AMPK、p-ULK1蛋白表达明显升高(P<0.05),p62蛋白表达明显降低(P<0.05);中药高剂量+顺铂组p62 mRNA表达明显降低(P<0.05),Beclin-1蛋白表达明显升高(P<0.05)。结论 归芪益元膏联合顺铂可能通过激活AMPK/ULK1信号通路促进肿瘤细胞自噬,进而抑制Lewis肺癌荷瘤小鼠皮下肿瘤生长。

MiR-139-5p通过ULK1减弱细胞自噬而抑制非小细胞肺癌

目的探究微RNA(miRNA)对肺癌的影响及具体机制,为后续抗癌生物制剂制作提供理论依据。方法肺癌组织和正常肺组织测序寻找表达差异的miRNA;搜寻肿瘤基因组谱(TCGA)数据库中肺癌患者数据验证miRNA和肺癌的关系;利用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)、细胞侵袭迁移试验(Transwell)、细胞流式术分别检测干预miRNA后的细胞活力、侵袭力、抗凋亡能力。生信分析miRNA的靶基因并验证其功能。结果肺癌组织和正常肺组织测序发现miR-139-5p在肺癌组织中表达降低;搜寻TCGA中的肺癌患者数据验证miR-139-5p的作用,发现miR-139-5p可能是个抑癌因子。行CCK-8、Transwell、细胞流式术发现miR-139-5p可以抑制肺癌细胞活力、侵袭力、抗凋亡能力。机制研究发现肺癌细胞的发展和自噬(autophagy)相关,且miR-139-5p可以直接靶向抑制自噬基因unc-51样激酶1(ULK1)而抑制肺癌发生自噬。下调ULK1基因可以使肺癌细胞活力、侵袭力、抗凋亡能力下降;而上调ULK1基因使肺癌细胞活力、侵袭力、抗凋亡能力提高。结论MiR-139-5p通过靶向抑制ULK1而减弱非小细胞肺癌发生自噬,进而减弱自噬的致癌效应。

苦参碱调节AMPK/mTOR/ULK1信号通路对七氟烷致新生大鼠线粒体自噬的影响

目的探讨苦参碱调节AMPK/mTOR/ULK1信号通路对七氟烷致新生大鼠线粒体自噬的影响。方法将新生大鼠分为对照组、七氟烷组、七氟烷+苦参碱低、高剂量组、七氟烷+苦参碱高剂量+Compound C(AMPK抑制剂)组,每组15只。ELISA法检测血清肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和IL-1β水平;HE染色观察海马组织损伤情况,TTC染色法检测大鼠脑梗死面积,TUNEL染色法检测大鼠脑正在细胞凋亡率,透射电子显微镜观察线粒体自噬情况;蛋白质印迹法检测大鼠自噬LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Parkin、PINK1、p62和AMPK/mTOR/ULK1信号通路相关蛋白。结果与对照组相比,七氟烷组大鼠海马神经元显著损伤,血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平、脑组织细胞凋亡率、脑梗死面积、p62蛋白表达显著升高,自噬小体和自噬溶酶体数量、脑组织中Parkin、PINK1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR、p-ULK1/ULK1蛋白表达显著降低(P<0.05);与七氟烷组相比,七氟烷+苦参碱低、高剂量组大鼠海马神经元损伤显著减轻,血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平、脑组织细胞凋亡率、脑梗死面积、p62蛋白表达显著降低,自噬小体和自噬溶酶体数量、脑组织中Parkin、PINK1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR、p-ULK1/ULK1蛋白表达显著升高(P<0.05);抑制剂Compound C可逆转苦参碱对新生大鼠神经元的保护作用。结论苦参碱通过激活AMPK/mTOR/ULK1信号通路增强线粒体自噬水平来减轻七氟烷诱导的新生大鼠神经元凋亡和炎性反应。

银杏内酯K调节AMPK/mTOR/ULK1信号通路对乳腺癌细胞自噬和凋亡的影响

目的 探讨银杏内酯K(GK)调节AMPK/mTOR/ULK1信号通路对乳腺癌细胞自噬和凋亡的影响。方法 取对数生长期的MCF-7细胞,设置分组为对照组、GK低浓度(GK-L,12.5μg/mL)组、GK中浓度(GK-M,25μg/mL)组、GK高浓度(GK-H,50μg/mL)组、GK-H+AMPK抑制剂(Compound C,50μg/mL GK+50μmol/L Compound C)组。观察各组细胞形态以及细胞增殖、凋亡、自噬状况并分析自噬相关基因LC3、P62、Beclin1 mRNA表达以及AMPK、p-mTOR、mTOR、p-ULK1、ULK1、LC3、P62、Beclin1表达。结果 与对照组相比,GK-L、GK-M、GK-H组细胞自噬泡数量增多,增殖率、p-mTOR/mTOR、p-ULK1/ULK1、p62表达显著下降,凋亡率、LC3、Beclin1表达、AMPK蛋白表达显著增加(P<0.05);与GK-H组相比,GK-H+Compound C组细胞自噬泡数量减少,增殖率、p-mTOR/mTOR、p-ULK1/ULK1、p62显著增加,凋亡率、LC3、Beclin1表达、AMPK蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论 GK可以诱导乳腺癌细胞自噬和凋亡、抑制其增殖,可能与激活AMPK/mTOR/ULK1信号通路有关。

温阳健脾方调节AMPK/mTOR/ULK1通路上调RSA小鼠孕期自噬水平改善其蜕膜化的机制研究

目的:探讨温阳健脾方通过影响AMPK/mTOR/ULK1信号轴调控RSA小鼠孕期自噬水平,从而对其蜕膜化影响的机制研究。方法:CBA/J雌鼠与BALB/c雄鼠合笼建立空白组10只,CBA/J雌鼠与DBA/2雄鼠合笼建立RSA小鼠模型,随机将其分为模型组、温阳健脾方中剂量组,10只/组;于妊娠第1天开始,温阳健脾方组予温阳健脾方13.96 g/(kg·d)灌胃,空白组及模型组予以等体积0.9%氯化钠溶液,连续干预14 d后眼球取血,取蜕膜组织,计算胚胎丢失率,ELISA测定各组小鼠血清中胰岛素样生长因子结合蛋白1(IGFBP-1)和催乳素(PRL),HE染色观察小鼠子宫内膜形态,Western blot法测定小鼠蜕膜组织AMPK、p-AMPK、p-mTOR、p-ULK1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p62表达。结果:与空白组相比,RSA模型组胚胎吸收率显著降低(P<0.01);血清中IGFBP-1、PRL降低,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白相对表达量显著下调(P<0.001),p-AMPK/AMPK、Beclin1蛋白相对表达量明显下降,mTOR、ULK1、p62蛋白表达水平显著上调(P<0.01);与模型组比较,温阳健脾方组胚胎吸收率明显降低(P<0.05);血清中IGFBP-1、PRL水平上升(P<0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p-AMPK/AMPK、Beclin1蛋白相对表达量均上调,mTOR、ULK1、p62蛋白相对表达量下调(P<0.05)。结论:温阳健脾方可通过AMPK/mTOR/ULK1通路促进RSA小鼠孕期自噬水平从而改善其蜕膜化,有效提高妊娠率。

金丝桃苷通过AMPK/mTOR/ULK1信号通路对肾病综合征大鼠自噬反应的影响

目的探究金丝桃苷(Hyp)对肾病综合征(nephrotic syndrome,NS)大鼠肾自噬及AMPK/mTOR/ULK1通路的影响。方法32只6周龄SD大鼠分为正常组(N组)、肾病综合征组(NS组)、金丝桃苷组(Hyp组,60 mg/kg Hyp)、金丝桃苷+AMPK抑制剂组(Hyp+CC组,60 mg/kg Hyp+0.2 mg/kg CC),每组8只。除N组外,其余各组大鼠采用一次性尾静脉注射阿霉素(6.5 mg/kg)建立NS模型,模型成功率为75.0%。Hyp组大鼠灌胃给予60 mg/kg的Hyp,Hyp+CC组给予60 mg/kg的Hyp灌胃和0.2 mg/kg CC腹腔注射,N组和NS组给予等量溶剂,每天1次,连续14 d。给药结束后,全自动分析仪检测24 h尿液总蛋白(UTP)、血尿素氮(BUN)、血清肌酐(Scr)和白蛋白(ALB)水平;HE染色观察肾组织病理形态;透射电子显微镜(TEM)观察肾组织超微结构变化;Western blot检测肾中自噬、足细胞及AMPK/mTOR/ULK1通路蛋白表达;免疫荧光染色观察自噬体和足细胞的定位。结果相比于N组,NS组肾小球体积变大、肾小管萎缩或部分消失、基底膜增厚;UTP、BUN、Scr、基底膜厚度、足突宽度及p-AMPK/AMPK比值显著增加(P<0.05),ALB、LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、Atg5、Atg7、NPHS2蛋白水平、NPHS2、Beclin-1相对荧光强度及p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1比值显著降低(P<0.05)。相比于NS组,Hyp治疗可改善肾小球形态,降低UTP、BUN、Scr、基底膜厚度、足突宽度及p-AMPK/AMPK比值(P<0.05),增加ALB、LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、Atg5、Atg7、NPHS2蛋白水平、NPHS2、Beclin-1相对荧光强度及p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1比值(P<0.05)。相比于Hyp组,Hyp+CC组肾小球体积变大、肾小管萎缩或部分消失、基底膜增厚;UTP、BUN、Scr、基底膜厚度、足突宽度及p-AMPK/AMPK比值显著增加(P<0.05),ALB、LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、Atg5、Atg7、NPHS2蛋白水平、NPHS2、Beclin-1相对荧光强度及p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1比值显著降低(P<0.05)。结论Hyp可能通过激活AMPK/mTOR/ULK1通路促进肾细胞自噬活性,减轻NS大鼠的足细胞损伤等肾病变。

基于AMPK/ULK1通路探讨鸢尾素对老年糖尿病肌少症大鼠肌保护作用及机制

目的 探讨鸢尾素调节AMPK/ULK1通路对老年糖尿病大鼠肌保护的作用及机制。方法随机选择10只大鼠作为对照组(CON组),40只大鼠通过链脲佐菌素(STZ)注射构建2型糖尿病(T2DM)模型。将造模成功的大鼠随机均分为模型组(Mod组)、鸢尾素组(30μg/kg)、Compound C组(0.2 mg/kg)、鸢尾素+Compound C组(30μg/kg+0.2 mg/kg),每组10只,每天一次给药,连续治疗4周。CON组和Mod组给予等量生理盐水注射。抓绳实验检测大鼠肢体肌肉力量;称量大鼠体重、腓肠肌重量,计算腓肠肌重量占体重百分比(腓/体);用血糖仪检测血糖水平;双抗体夹心法检测血清胰岛素水平;苏木精-伊红(HE)染色检测腓肠肌病理变化;Western blot检测自噬蛋白、AMPK/ULK1通路蛋白表达。结果 CON组大鼠肌细胞排列有序,无水肿坏死现象;Mod组大鼠肌细胞排列杂乱,出现细胞水肿、坏死以及炎性浸润现象,同时部分肌纤维出现溶解现象;鸢尾素组改善了以上现象,与CON组结构类似;Compound C组大鼠肌细胞水肿、坏死、炎性浸润现象加重,鸢尾素+Compound C组结构与Mod组相似;与CON组[(3.13±0.42)min、(0.53±0.06)ng/mL、(5.67±0.45)mmol/L、(0.13±0.01)%]相比,Mod组大鼠抓绳时间[(1.48±0.17)min]、体重、腓肠肌重量以及腓/体、胰岛素含量[(0.36±0.04)ng/mL]、Beclin1、LC3-II/I蛋白水平、p-AMPK/AMPK、ULK1蛋白水平显著下降(P<0.05),血糖[(23.68±1.98)mmol/L]、IRI[(0.38±0.04)%]显著升高(P<0.05);与Mod组相比,鸢尾素组大鼠抓绳时间[(2.89±0.31)min]、体重、腓肠肌重量以及腓/体、胰岛素含量[(0.50±0.07)ng/mL]、Beclin1、LC3-II/I蛋白水平、p-AMPK/AMPK、ULK1蛋白水平显著上升(P<0.05),血糖[(8.62±0.62)mmol/L]、IRI[(0.19±0.01)%]显著降低(P<0.05),而Compound C组[(0.51±0.05)min、(0.24±0.02)ng/mL、(48.43±2.23)mmol/L、(0.52±0.05)%]趋势与之相反,Compound C减弱了鸢尾素对老年糖尿病大鼠的肌保护作用。结论鸢尾素可能通过激活AMPK/ULK1通路起到对老年糖尿病大鼠肌保护的作用。

ULK1翻译后修饰调控细胞自噬的研究进展

UNC-51样激酶1(Unc-51 Like Kinase 1, ULK1)作为自噬启动因子,在自噬的发生、维持细胞内环境的稳态发挥着重要的作用。ULK1具有多个功能结构域,通过发挥不同的作用精确调控特定的下游靶标,从而实现对特定信号通路的调控。蛋白质翻译后修饰(Post-translational Modifications, PTMs)是目前蛋白研究的热点,许多研究证实ULK1受多种翻译后修饰调控,包括磷酸化、泛素化、乙酰化等。本文综述了ULK1不同翻译后修饰在自噬中的调控作用,并介绍了针对于ULK1设计的的小分子化合物,以期为自噬领域的研究和探索自噬相关疾病的治疗和预防提供参考。

绞股蓝总甙调控mTOR/ULK1通路对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的影响

目的 基于mTOR/ULK1自噬信号通路探讨绞股蓝总甙改善动脉粥样硬化模型小鼠主动脉脂质沉积的作用机制。方法 30只健康ApoE^（-/-）小鼠随机分为模型对照组、绞股蓝总甙组和辛伐他汀组,每组10只。10只C57BL/6J小鼠作为正常组。模型对照组、绞股蓝总甙组和辛伐他汀组采用高脂饲料喂养4周,绞股蓝总甙组和辛伐他汀组分别采用绞股蓝总甙2.973 g/（kg·d）、辛伐他汀2.275 mg/（kg·d）灌胃8周,模型对照组、正常组予等量生理盐水灌胃。HE染色观察小鼠动脉粥样硬化斑块形成情况,全自动生化分析仪检测血脂水平,Western blot检测主动脉ULK1、Beclin1、LC3、p-mTOR的蛋白表达。结果 与正常组相比,模型对照组TG、TC和LDLC水平升高（P〈0.05）,HDLC水平降低（P〈0.05）,主动脉管腔见较大粥样斑块,ULK1、Beclin1、LC3蛋白表达水平下调（P〈0.01）,pmTOR蛋白表达水平上调（P〈0.01）;与模型对照组相比,绞股蓝总甙组和辛伐他汀组TG、TC和LDLC水平降低（P〈0.05）,HDLC水平升高（P〈0.05）,主动脉管腔粥样斑块明显减少,ULK1、Beclin1、LC3蛋白表达水平上调（P〈0.01）,p-mTOR蛋白表达水平呈下调趋势（P〈0.01或P〈0.05）。结论 绞股蓝总甙可能通过调控自噬缓解动脉粥样硬化斑块形成,进而防治动脉粥样硬化。

电针“足三里”穴对脾气虚大鼠肌肉组织内线粒体自噬相关因子MUL1及ULK1表达的影响

目的:观察电针双侧"足三里"穴对脾气虚模型大鼠肌肉组织内线粒体自噬相关因子MUL1和ULK1基因及蛋白表达的影响。方法:32只SD雄性大鼠按随机数字表法分为4组:空白组、脾气虚组、治疗组、非经非穴组,每组8只。采用劳倦过度和不规则饮食复合法复制脾气虚证大鼠模型,依据造模评定标准造模成功后,治疗组大鼠给予电针双侧"足三里"穴治疗处理,非经非穴组大鼠给予电针双侧非经非穴点干预处理,1次/d,20min/次,空白组及脾气虚组大鼠在操作台上固定20min,不给予其它处理。干预7d后取胃及骨骼肌组织,采用荧光定量PCR法检测大鼠胃及骨骼肌组织MUL1和ULK1 mRNA表达水平,蛋白质免疫印迹法(WB)检测大鼠胃及骨骼肌组织内MUL1和ULK1蛋白含量变化。结果:脾气虚组和非经非穴组大鼠胃及骨骼肌组织内MUL1 mRNA和蛋白表达水平均明显高于空白组,ULK1 mRNA及蛋白表达下降(P <0. 05);治疗组大鼠胃及骨骼肌组织MUL1 mRNA和蛋白表达水平相比于脾气虚组有所下降,ULK1mRNA及蛋白表达升高(P <0. 05);非经非穴组同脾气虚组相比无统计学意义(P <0. 05)。结论:电针"足三里"穴可以从转录水平上抑制脾气虚大鼠肌肉组织内MUL1的过表达,稳定ULK1的调节作用,参与线粒体自噬的调控作用进而改善脾气虚证。

自噬相关基因ULK1在外阴鳞癌中的表达及临床意义

目的研究自噬相关基因ULK1在外阴鳞癌中的表达及其与外阴鳞癌临床病理特征和预后的关系。方法收集48例外阴鳞癌组织和20例正常外阴组织,采用免疫组织化学法检测标本中ULK1的表达,分析其表达与外阴鳞癌患者临床病理特征之间的关系,并对外阴鳞癌患者进行随访以探讨ULK1表达与患者预后的相关性。结果 ULK1在正常外阴组织中表达率为80.0%,明显高于外阴鳞癌组织中的表达率(54.2%),差异有统计学意义(P=0.046)。ULK1表达情况与外阴鳞癌患者FIGO分期(P=0.017)、肿瘤浸润深度(P=0.028)及淋巴结转移状况(P=0.017)显著相关。ULK1表达阳性患者的生存率明显优于表达阴性的患者(P=0.010)。Cox回归模型多因素分析结果显示,ULK1表达是与患者生存时间相关的独立预后因素(P=0.041)。结论 ULK1在外阴鳞癌中表达下降,且与患者FIGO分期、肿瘤浸润深度及淋巴结转移状况相关,可作为判断外阴鳞癌预后新的生物学标志物。

丹参酮ⅡA对大鼠缺血再灌注肾组织AMPK/ULK1通路的影响

目的观察丹参酮ⅡA对大鼠肾缺血再灌注后腺苷单磷酸激活蛋白激酶(AMPK)/自噬激活激酶1(ULK1)通路的影响,探讨其肾脏保护的作用机制。方法将30只健康雄性Wistar大鼠随机分为丹参酮ⅡA组、缺血再灌注组、假手术组,每组10只。丹参酮ⅡA组于缺血前30 min尾静脉注射丹参酮ⅡA注射液0.5 mg/kg,假手术组和缺血再灌注组注射等量的生理盐水。丹参酮ⅡA组和缺血再灌注组通过双侧肾蒂夹闭45 min的方法建立肾缺血再灌注模型,假手术组打开腹腔后不夹闭双侧肾蒂。再灌注24 h后心脏采血,检测血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)水平;取肾组织,采用HE染色观察各组肾组织病理改变,Western blot法测定肾组织中AMPK、ULK1表达水平。结果缺血再灌注组大鼠血清Cr、BUN、TNF-α、IL-6、IL-10水平及肾组织中AMPK、ULK1表达水平均明显高于假手术组(P均<O.05);丹参酮ⅡA组大鼠血清Cr、BUN、TNF-α、IL-6水平及肾组织中AMPK、ULK1表达水平均明显低于缺血再灌注组(P均<0.05),血清IL-10水平明显高于缺血再灌注组(P<0.05);丹参酮ⅡA组大鼠肾组织病理学改变明显轻于缺血再灌注组。结论丹参酮ⅡA能减轻肾缺血再灌注造成的肾损伤,其可能通过抑制AMPK/ULK1通路调控自噬,减轻肾脏炎症反应而起肾脏保护作用。

miRNA-140靶向结合自噬相关基因ULK1的验证

背景:自噬可以通过抑制凋亡来缓解膝骨关节炎,miR-140是否可以调节自噬关键基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶-失调51样激酶1(uncoordinated 51 like kinase-1,ULK1)基因未见报道。目的:探索miRNA-140对ULK1基因的调控关系。方法:通过miRNA靶基因预测网站预测ULK1基因是否为miRNA-140的靶基因;将ULK1基因的3'端非翻译区全长序列载入海肾荧光素酶基因的下游,通过构建结合位点的突变序列,得到野生型和突变型载体,分别用野生型和突变型海肾荧光素酶载体转染293T细胞,检测每种转染细胞海肾荧光素酶的表达活性;运用miRNA-140 inhibitor对293T细胞进行干预,Western blot检测ULK1蛋白表达水平。结果与结论:与野生型载体组细胞相比,加入miR-140 mimics后荧光素酶的表达活性明显降低(P<0.01);当抑制miRNA-140后,ULK1蛋白的表达明显升高(P<0.01)。结果证实,miRNA-140可以与ULK1基因靶向结合从而调控其表达。

自噬相关基因ULK1在前列腺癌中的表达及临床意义

目的研究人自噬相关基因ULK1在前列腺癌中的表达及其与前列腺癌临床病理特征、预后的关系。方法利用免疫组织化学的方法检测ULK1前列腺癌组织及良性前列腺增生组织中的表达水平,分析ULK1蛋白的表达水平与前列腺癌患者临床特征的关系。结果 ULK1阳性率在前列腺癌组中为62.3%,在良性前列腺增生组织中为83.3%,两者差异有统计学意义(P<0.05)。前列腺癌Gleason评分高、临床分期晚患者的ULK1表达水平降低(P<0.05),而不同年龄、血清前列腺特异抗原(PSA)水平、手术切缘阳性情况患者的ULK1表达水平无明显差异(P>0.05)。ULK1表达阴性组前列腺癌患者的无生化复发率明显高于表达阳性者(P<0.05)。结论 ULK1在前列腺癌组织中表达下调、表达水平较低者的临床预后较差。

竹节香附素A通过ULK1/Atg13及ROS途径调控肝癌细胞自噬的作用研究

目的探讨竹节香附素A通过自噬激活激酶1(ULK1)/自噬相关蛋白13(Atg13)及活性氧(ROS)途径调控肝癌细胞自噬的作用。方法2019年8—9月于开滦总医院实验室进行实验,设肝癌HepG2细胞组、5-氟尿嘧啶组(80 mg/μl)、竹节香附素A低剂量组(100 mg/μl)、竹节香附素A高剂量组(200 mg/μl),4组每孔设6个平行样,培养72 h,培养结束后,测定细胞存活率、自噬、凋亡率,检测ULK1、Atg13 mRNA和蛋白水平,2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)测定ROS水平。结果与肝癌HepG2细胞组比较,5-氟尿嘧啶组及竹节香附素A低、高剂量组HepG2细胞OD值、存活率降低(P<0.01),自噬小体、HepG2细胞凋亡率、ULK1、Atg13 mRNA和蛋白表达、ROS水平升高(P<0.01);与5-氟尿嘧啶组比较,竹节香附素A低、高剂量组细胞OD值、存活率升高(t/P=21.214/0.000、19.547/0.000、18.547/0.000、25.478/0.000),自噬小体、凋亡率、ULK1、Atg13 mRNA和蛋白表达水平、ROS水平降低(t/P=16.325/0.000、22.547/0.000、9.874/0.000、16.589/0.000、13.654/0.000、14.654/0.000、16.589/0.000、21.247/0.000、21.687/0.000、18.324/0.000、18.541/0.000、19.587/0.000、19.654/0.000、24.052/0.000);与竹节香附素A低剂量组比较,竹节香附素A高剂量组细胞OD值、存活率降低(t/P=16.547/0.000、23.547/0.000),自噬小体、凋亡率、ULK1、Atg13 mRNA和蛋白表达水平、ROS水平升高(t/P=15.696/0.000、10.654/0.000、14.697/0.000、18.324/0.000、17.024/0.000、19.634/0.000、18.547/0.000)。结论竹节香附素A能明显抑制肝癌细胞增殖,促进肝癌细胞自噬及凋亡;其机制与竹节香附素A激活ULK1/Atg13及ROS通路有关。

pSicoR/miR-17-5p靶向调控UNC-51样激酶1(ULK1)及其对细胞自噬的影响

目的为了探讨miR-17-5p对自噬相关基因ULK1的调控作用及其对细胞自噬的影响,为更深入研究miR-17-5p调控细胞自噬机制建立理论依据。方法构建p Sico R-miR-17-5p过表达重组质粒,包装miR-17-5p过表达慢病毒,构建ULK1及其突变体ULK1-mut的pmiR-report载体,通过双荧光素酶报告系统验证miR-17-5p对ULK1的靶向关系,利用Western blot检测ULK1与LC3B蛋白的表达量。结果成功构建p Sico R-miR-17-5p过表达重组质粒并且成功将ULK1及其突变体ULK1-mut的3′-UTR插入到pmiR-report载体中;双荧光素酶报告系统结果表明转染miR-17-5p及ULK1-3′-UTR,miR-17-5p过表达组相比对照组相对荧光强度降低1.9倍(P<0.05),说明miR-17-5p对ULK1的表达有抑制作用,而转染miR-17-5p及mut-ULK1-3′-UTR之后检测显示相对荧光强度并没有降低,说明miR-17-5p是靶向作用于ULK1,并对其进行负调控;Western blot显示miR-17-5p抑制ULK1蛋白的表达,并且抑制LC3II/I蛋白的表达。结论 miR-17-5p直接靶向作用于自噬相关基因ULK1,并且对其负调控,抑制细胞自噬的发生。