含绿色荧光蛋白基因的鸭肠炎病毒SD-01株US2基因缺失转移载体的构建

以鸭肠炎病毒(DEV)SD-01株DNA为模板,根据Gen Bank上已发表的基因序列设计一对引物,利用PCR技术扩增出US2全基因,将PCR产物连入pGM-T载体。用BamHI和EcoR V双酶切重组载体,使US2基因缺失约130bp,将含双loxP酶切位点的EGFP完整表达盒插入BamH I和EcoR V酶切位点之间,成功构建了以US2基因为重组臂的含EGFP基因的转移质粒载体pUS2-loxP-EGFP-loxP。

鸭肠炎病毒us2基因转移载体的构建

以鸭肠炎病毒(DEV)C-KCE株基因组DNA为模板,PCR扩增得到us2全基因(包含s3、us3部分基因),将扩增产物克隆入pMD18-T载体,EcoRⅠ和HindⅢ双酶切连入pUC19载体,获得质粒pUC-us2。将完整的EGFP表达盒插入us2基因内BamHⅠ位点,得到转移载体质粒pUC-us2-EGFP。脂质体法将转移载体质粒pUC-us2-EGFP转染DEF细胞,观察到绿色荧光,说明EGFP基因获得表达。

鸭肠炎病毒US2基因的序列测定与分析

以鸭肠炎病毒（DEV）SD-01株DNA为模板，根据GenBank上已发表的基因序列设计一对引物，利用PCR技术扩增出UE2全基因，将目的条带连入pGM—T载体，得到的阳性重组质粒命名为pGM—US2并进行序列测定。将测序结果与疫苗株、鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗（C—KCE）株和单纯疱疹病毒-1型（HSV-1）、马立克氏病病毒（MDV）、伪狂犬病病毒（PRV）的US2基因同源性进行比较，发现核昔酸和氨基酸的序列同源性分别为100％～25．8％和100％～28％。结果表明，US2基因在DEV中是完全保守的，但与其它疱疹病毒相比同源性较低。