泛素特异性蛋白酶15稳定着色性干皮病F蛋白并促进DNA链间交联损伤修复

着色性干皮病F蛋白(xeroderma pigmentosum group F,XPF)和切除修复交叉互补组1蛋白(excision repair cross complementing group 1,ERCC1)组成一种结构特异性的核酸内切酶(XPFERCC1)复合物,参与DNA链间交联(interstrand crosslink,ICL)损伤修复。其中,XPF蛋白的去泛素化修饰对DNA损伤修复的影响尚未见报道。本工作主要研究泛素特异性蛋白酶15 (ubiquitinspecific protease 15,USP15)对XPF的稳定性及ICL修复的影响。本研究通过蛋白质质谱和Western印迹法分析发现,XPF蛋白与USP15存在相互作用,进而使XPF蛋白去泛素化修饰;采用CRISPR-Cas9技术构建USP15基因敲除的He La细胞株(USP15 KO)并进行Western印迹分析,结果显示,敲除组XPF蛋白水平低于对照组(P<0. 001)。克隆形成试验显示,在ICL诱导剂顺铂(cisplatin,DDP)和丝裂霉素C (mitomycin,MMC)的作用下,USP15基因敲除的HeLa细胞增殖能力显著降低(P<0. 01)。本研究表明,去泛素化酶USP15是一种重要的DNA修复调节因子,该酶通过稳定XPF蛋白促进由XPF-ERCC1介导的ICL修复。本研究为改善ICL诱导剂类抗癌药物的耐药性提供了理论依据,并为肿瘤的治疗提供了潜在的新靶点。

甲基转移酶PRMT5稳定USP15促进乳腺癌发生发展的作用

目的 探讨蛋白精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)通过甲基化作用,修饰并上调泛素特异性蛋白酶15(USP15)的蛋白水平,从而促进乳腺癌发生发展的作用。方法 采用基因表达谱交互分析(GEPIA2)在线数据库和Kaplan-Meier Plotter生存曲线分析,分析PRMT5在肿瘤组织和正常组织中的表达差异,及其与乳腺癌患者临床预后的关系。采用免疫亲和纯化及银染联合质谱分析得到与PRMT5结合的蛋白。通过慢病毒稳转技术在MCF-7细胞中过表达或敲低PRMT5,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及蛋白免疫印迹(Western blotting)技术检测细胞内相关蛋白的表达。质粒或小干扰RNA(siRNA)转染技术敲低或过表达USP15,qRT-PCR及Western blotting技术检测细胞内相关蛋白表达,采用细胞活性实验(CCK8)、克隆形成和Transwell实验检测其对乳腺癌细胞增殖与侵袭能力的影响。利用EPZ015666(GSK3235025)小分子抑制剂抑制PRMT5甲基转移酶活性后,采用Western blotting技术检测细胞内相关蛋白的变化,采用CCK8和Transwell实验检测其对乳腺癌细胞增殖和侵袭能力的影响。结果 生物信息学分析结果显示,PRMT5在乳腺癌患者中高表达并与乳腺癌患者不良预后相关。免疫亲和纯化及银染联合质谱分析并通过免疫共沉淀(Co-IP)实验验证,发现PRMT5与USP15存在相互结合。在乳腺癌细胞MCF-7中,过表达FLAG-PRMT5后,通过Western blotting和qRT-PCR实验检测,发现USP15的蛋白水平明显增加,而不影响USP15的mRNA水平;敲低PRMT5表达后,USP15的蛋白水平降低,而mRNA水平未发生改变。在MCF-7细胞中,过表达Myc-USP15明显降低FBXW7的mRNA及蛋白水平,细胞功能实验结果显示,细胞的增殖和侵袭能力增加,敲低USP15则结果相反。Western blotting和细胞功能实验结果显示,EPZ015666抑制PRMT5的甲基转移酶活性后,可通过降低USP15的蛋白水平降低细胞的增殖和侵袭能力。结论 乳腺癌细胞中PRMT5与USP15相互结合,并以甲基转移酶活性依赖的方式上调USP15的蛋白水平。USP15的升高可通过催化组蛋白H2BK120ub的去泛素化修饰,使FBXW7基因转录激活被抑制,进而促进乳腺癌细胞增殖和上皮-间质转化过程等,促进乳腺癌的发生与进展,PRMT5是乳腺癌潜在的诊断及干预治疗靶点。

IFN-I通路中的ISG15、USP18及MxA表达在特发性炎性肌病中的研究

皮肌炎本质上属于一种自身免疫性疾病,主要是由于免疫功能紊乱而导致的。通常情况下,主要表现为对称性四肢近端肌无力,与此同时,还可能出现骨骼肌以及皮肤损害的情况。近年来研究发现,Ⅰ型干扰素介导的相关信号通路在皮肌炎的发病中具有重要意义,其中以ISG15、USP18及MxA通路蛋白的表达在皮肌炎发病中所起的作用正在成为新的研究方向。本文对Ⅰ型干扰素的产生、Ⅰ型干扰素在JAK/STATs通路中的作用机制、Ⅰ型干扰素下游的表达产物ISG15、USP18及MxA等,在皮肌炎发病中的作用进行综述。