ERK1/2信号通路基因3'UTR多态性与非小细胞肺癌的相关性

目的探究4个ERK1/2信号通路的基因3'UTR区域的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点(MAPK1基因中的rs9340,NRAS基因中的rs14804,KRAS基因中的rs712和rs7973450)与非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的相关性。方法纳入了478名NSCLC患者及480名健康对照者,利用TaqMan探针法对其进行基因分型检测,并分析上述4个SNP与NSCLC的相关性。结果rs9340位点的等位基因在对照组与非小细胞鳞状细胞癌组(squamous cell carcinoma,SCC)中分布频率的差异具有统计学意义(P=0.009),该结果表明rs9340位点的G等位基因可能是非小细胞肺鳞癌的保护性因素(OR=0.67,95%CI:0.50~0.91)。同时,在<50岁年龄组中,rs9340位点的等位基因在对照组和NSCLC组中的分布频率差异具有统计学意义(P=5.07×10^(-4)),该结果表明rs9340等位基因G可能是NSCLC的保护性因素(OR=0.46,95%CI:0.29~0.72)。结论MAPK1基因SNP位点rs9340可能与NSCLC的发生风险相关。

HSV-1即刻早期基因的5′UTR对报告基因mRNA翻译的影响

mRNA疫苗的5′非翻译区(5’untranslated regions,5′UTR)对其表达起着重要作用,报告基因增强绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein,EGFP)用于检测5′UTR调控mRNA表达已经是一个较为成熟的实验方法.为研究单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus 1,HSV-1)即刻早期基因的5′UTR作为报告基因EGFP mRNA的5′UTR对其翻译的影响,本研究将4个即刻早期基因的5’UTR以及表达能力较强的人β珠蛋白基因(humanβGlobin,hBg)5′UTR插入报告基因EGFP 5’端,通过观察绿色荧光强度研究不同即刻早期基因5′UTR对mRNA翻译的影响.结果表明:经mRNA转染试剂和纳米脂质体颗粒分别递送进293T细胞和小鼠体内;RL2的5′UTR作为报告基因EGFP 5′UTR的表达水平与hBg 5′UTR相近,RS1、US1、US12表达水平明显弱于hBg 5′UTR.因此,RL2基因的5′UTR有潜力作为mRNA疫苗的5′UTR.

狭缝引导配体13′UTR通过miR-34a-5p/SIRT1轴调节内皮细胞表型

在高等生物的进化过程中,mRNA的3′非翻译区(3′untranslated region,3′UTR)序列显著增加,提示3′UTR在生物功能调节中可能发挥重要作用。我们发现狭缝引导配体1(slit guidance ligand 1,SLIT1)3′UTR在肥厚型心肌病(HCM)患者心肌中水平降低,但其对肥厚心肌中血管功能调节的作用机制不清楚。利用腺病毒介导在主动脉内皮细胞(human aortic endothelial cells,HAECs)中过表达SLIT13′UTR,检测HAECs中一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthases,eNOS)和血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor,VEGFA)表达。分别采用划痕实验和基于Matrigel胶的管腔形成实验检测HAECs的迁移和成管腔能力。结果发现,过表达SLIT13′UTR会升高HAECs中p-eNOS、eNOS和VEGFA水平(P<0.01),并促进HAECs迁移和成管腔能力(P<0.01)。生物信息学预测提示,SLIT13′UTR上有多个微RNA(miRNA)的潜在结合位点,反义RNA纯化技术(RNA antisense purification,RAP)筛选和利用Ago2抗体进行RNA结合蛋白质免疫沉淀(RNA binding protein immunoprecipitation,RIP)结果显示,SLIT13′UTR与miR-34a-5p存在结合作用,而过表达SLIT13′UTR的HAECs中miR-34a-5p水平显著降低(P<0.05)。Western印迹结果证实,miR-34a-5p可逆转过表达SLIT13′UTR对去乙酰化酶SIRT1的上调作用(P<0.05)。在HAECs中转染miR-34a-5p和si-SIRT1,可一致地抑制过表达SLIT13′UTR引起的p-eNOS、eNOS和VEGFA增加(P<0.05,P<0.01),及促进HAECs迁移和成管腔的能力(P<0.01,P<0.001)。因此,SLIT13′UTR可以特异性吸附miR-34a-5p,通过miR-34a-5p/SIRT1轴发挥促进内皮细胞迁移和管腔生成的作用。

ZEB1-3′UTR促进乳腺癌细胞MCF-7迁移机制的研究

对与ZEB1-3′UTR结合的microR-NAs进行生物信息学分析。结果表明,与对照组相比,过表达ZEB1-3′UTR后MCF-7细胞迁移能力显著增强。采用RNA22、Microrna、Targetscan数据库筛选出与ZEB1-3′UTR结合的microRNAs,三个数据库公共预测的microRNAs有9个,分别是miR-429、miR-200b、miR-200c、miR-494、miR-873、miR-381、miR-300、miR-431和miR-342,其中miR-429、miR-200b、miR-200c、miR-342在乳腺癌中高表达。以上研究表明,ZEB1-3′UTR能够竞争性结合肿瘤细胞表达的内源性microRNAs,促进了MCF-7细胞迁移。

CXCR4-3’-UTR双荧光素酶报告基因载体的构建及与microRNA-494的靶向作用

目的 构建野生型与突变型CXCR4基因3’-非编码区(3’-UTR)的双荧光素酶报告基因载体,验证microRNA-494 (miR-494)对CXCR4的靶向调控作用。方法 使用生物信息学相关软件预测miR-494与CXCR4之间的靶向关系;利用PCR法扩增CXCR4的目的基因片段构建野生型与突变型CXCR4基因3’-UTR的双荧光素酶报告基因载体;将miR-494模拟物和阴性对照物分别与野生型pMIR-CXCR4-wt-3’-UTR或突变型pMIR-CXCR4-mut-3’-UTR双荧光素酶报告基因载体共同转染NRK-49F细胞,然后进一步检测相对荧光值。结果 成功构建野生型与突变型CXCR4基因3’-UTR的双荧光素酶报告基因载体,荧光结果显示加入miR-494模拟物可使野生型pMIR-CXCR4-wt-3’-UTR的荧光素酶活性降低约52%,但突变型pMIR-CXCR4-mut-3’-UTR的荧光素酶活性与对照组相比无显著变化。结论 初步证实miR-494与CXCR4之间存在靶向调控关系。

LGALS3BP 3’UTR荧光素酶报告基因载体构建及鉴定

目的构建LGALS3BP(lectin,galactoside-binding,soluble,3 binding protein,LGALS3BP)基因3’非编码区(3’-untranslated region,3’UTR)的野生型及突变型荧光素酶报告基因重组载体并进行鉴定,以备进一步研究miRNA对LGALS3BP基因的调控。方法Targetscan软件预测LGALS3BP 3’UTR上的miRNA结合位点;以人肝癌细胞系SMMC-7721基因组DNA为模板,进行PCR扩增,获得野生型LGALS3BP基因3’UTR片段,经双酶切将目的片段定向插入报告基因载体pGL3-Control中,将克隆好的重组载体转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞进行扩增,采用菌落PCR及测序监定重组子。设计位点突变型LGALS3BP 3’UTR扩增引物,以构建的野生型LGALS3BP 3’UTR重组质粒为模板,采用重叠PCR及定点突变PCR技术进行扩增分别构建单独位点及双位点突变型重组荧光素酶报告基因载体。结果野生型LGALS3BP 3’UTR重组质粒经菌落PCR鉴定,可见871 bp的目的基因片段,大小与预期相符;测序结果表明,插入序列与LGALS3BP 3’UTR序列完全一致且插入方向正确。Targetscan软件预测到LGALS3BP 3’UTR区有两个感兴趣的miRNA结合位点。突变型LGALS3BP 3’UTR重组质粒测序鉴定结果表明,单独位点及双位点突变型重组质粒中均成功引入结合位点突变。结论成功构建LGALS3BP的3’UTR野生型(pGL3-LGAL-W-3’UTR)、两个单独位点突变型(pGL3-LGAL-M1-3’UTR和pGL3-LGAL-M2-3’UTR)及双位点突变型(pGL3-LGAL-M-3’UTR)重组荧光素酶报告基因载体,为后续研究miRNA对LGALS3BP基因的调控奠定基础。

关岭牛MSTN基因3'-UTR与bta-miR-27b的靶向验证

【目的】明确关岭牛bta-miR-27b与肌肉生长抑制素基因(MSTN)的结合位点及靶向调控关系,为通过调控miRNA改良关岭牛产肉量提供理论依据,也为贵州地方黄牛分子遗传改良工作提供新的切入点。【方法】通过TargetScan预测牛MSTN基因3'端非翻译区(3'-UTR)的潜在miRNA结合区域及互作miRNA,对比关岭牛与不同关岭牛杂交品种的生理表型及MSTN基因和3'-UTR端miRNA表达差异,并分析bta-miR-27b在不同关岭牛杂交群体中的靶位点特异性。将MSTN基因3'-UTR序列野生型(WT)和3'-UTR序列突变型(MUT)分别克隆至pMIR-REPORT Luciferase(H306)载体构建重组双荧光素酶报告基因载体,与bta-miR-27b共转染293T细胞以验证bta-miR-27b与MSTN基因的作用关系,并利用实时荧光定量PCR验证bta-miR-27b对MSTN基因表达的影响。【结果】在牛MSTN基因3'-UTR端发现7个miRNA结合位点;关岭牛各系杂交品种的3个miRNA(bta-miR-27a-3p、bta-miR-27b和bta-miR-128)相对表达量均极显著高于关岭牛(P<0.01,下同),MSTN基因相对表达量极显著低于关岭牛,体质量、体高、体斜长、胸围等生长指标却明显优于关岭牛。关岭牛及其杂交牛MSTN基因3'-UTR端的bta-miR-27b结合区域均无突变、无缺失;MSTN-3'-UTR(WT)与bta-miR-27bmimics共转染293T细胞后其相对荧光值下降53.80%,极显著低于MSTN-3'-UTR(MUT)+bta-miR-27bmimics共转染;转染bta-miR-27b mimics后,bta-miR-27b在关岭牛原代成肌细胞株(N2)中成功超表达,而MSTN基因相对表达量呈极显著下调趋势,表明bta-miR-27b能抑制MSTN基因表达。【结论】bta-miR-27b与MSTN基因的结合区域位于3'-UTR端第62~69位碱基处,且靶位点保守性较高。bta-miR-27b对MSTN基因有很强的靶向调控作用,表现为bta-miR-27b能抑制MSTN基因表达。

家兔BMP7基因3′UTR的克隆及序列分析

【目的】研究家兔BMP7基因3′非翻译区(3′UTR)序列的结构及功能特点。【方法】以家兔肾脏组织为材料,应用3′RACE技术对家兔BMP7基因3′UTR序列进行扩增,并与GenBank中登陆的其他哺乳动物相应序列进行比较分析。【结果】成功克隆了家兔BMP7基因的3′UTR(GenBank号:EU004072);在3′UTR序列末端存在2个切割与胞质多聚腺苷化特异因子(CPSF)结合位点(AAUAAA)和1个11 bp的poly(A)。家兔BMP7基因3′UTR序列与小鼠、人、牛和猪的一致性分别为41.45%,50.30%,47.84%和57.91%,相对不保守。【结论】家兔BMP7基因3′UTR结构特点可能与其基因功能有关。

草原红牛胰岛素样生长因子Ⅰ受体基因3′UTR序列多态性分析

以58头草原红牛为试验材料,采用PCR-SSCP技术对胰岛素样生长因子Ⅰ受体(IGF-ⅠR)基因3′UTR序列多态性进行了检测。结果表明,在IGF-ⅠR基因3′UTR中发现PCR-SSCP的多态位点,有2种等位基因和3种基因型。对所得基因型与生长和胴体性状的相关性分析结果发现,在3′UTR中AB型的胴体产肉率、肉骨比显著高于AA、BB型(P<0.05);AA型的脂肪覆盖率显著高于BB型(P<0.05),与AB型差异不显著(P>0.05)。

中国美利奴羊DLX3基因3′UTR的多态性及其与羊毛品质性状的关联分析

为探讨DLX3基因的多态性与绵羊羊毛品质及生长性状的关系,本研究以5个品系的中国美利奴羊(新疆军垦型)为试验材料,采用PCR-RFLP方法开展了DLX3基因3′UTR区4个SNPs的多态性检测。通过卡方检验分析了4个SNPs在各品系绵羊中的等位基因频率,采用连锁不平衡分析构建了这4个SNPs的单倍型,最后将单位点和单倍型分别与绵羊羊毛品质和生长性状进行关联分析。结果表明:4个SNPs在5个品系间的等位基因频率均存在极显著差异(P<0.01);超细毛绵羊品系与其他4个品系间的基因型分布均存在极显著差异(P<0.01),2个多胎品系与其他3个品系间的基因型分布同样存在极显著差异(P<0.01);相关分析显示,这4个SNPs及其单倍型均对羊毛卷曲度有显著影响(P<0.05),而对其他羊毛性状及生长性状无显著影响(P>0.05)。由此可见,中国美利奴羊(新疆军垦型)DLX3基因3′UTR区的多态性与绵羊毛发卷曲度性状显著相关,可以尝试使用这些SNPs开展高品质细毛羊的分子标记辅助选择。

鸡IGFBP2基因3′UTR区1196C>A单核苷酸多态性的功能性鉴定及分析

鸡IGFBP2基因3′非编码区(3′UTR)1196C>A单核苷酸多态性(SNP)与鸡的腹脂重和腹脂率显著相关.生物信息学分析显示,该SNP恰好位于gga-mi R-456-3p的一个潜在靶基因结合位点处,提示IGFBP2基因可能是gga-mi R-456-3p的一个靶基因,且该SNP位点可能影响gga-mi R-456-3p对IGFBP2基因表达的调控作用.为鉴定SNP 1196C>A是否为功能性SNP,本研究分别构建了包含该SNP位点C或A等位基因的双荧光素酶报告基因载体,比较分析这两个等位基因在鸡胚成纤维细胞系(DF1)和鸡前脂肪细胞中对报告基因活性和表达的影响;利用mi RNA mimics和inhibitor分析gga-mi R-456-3p对不同等位基因报告基因活性以及内源性IGFBP2表达的影响.结果发现,在DF1细胞和鸡前脂肪细胞中,A等位基因的报告基因活性和表达均显著高于C等位基因(P<0.05);gga-mi R-456-3p仅影响C等位基因的报告基因活性和表达,而对A等位基因的报告基因活性没有明显影响;gga-mi R-456-3p调控细胞内源性IGFBP2基因的m RNA和蛋白质表达.本研究证实IGFBP2基因是gga-mi R-456-3p的靶基因,其3′UTR区SNP 1196C>A是一个功能性SNP,它影响gga-mi R-456-3p对鸡IGFBP2基因的表达调控作用.本研究结果对于鸡的分子辅助选择育种及IGFBP2基因在脂肪沉积中调控机制的阐明具有重要意义.

鼻咽癌表达下调基因NASG3'UTR可变剪接分析及其在多种肿瘤中的表达

背景与目的:采用抑制性消减杂交技术已分离获得了人鼻咽组织特异性基因NASG。本研究对人鼻咽组织特异性表达且在鼻咽癌表达下调的NASG基因3'非编码区(untranslatedregion,UTR)的可变剪接进行分析,并考察NASG基因在多种肿瘤组织中的表达。方法:在NASG基因3'UTR存在可变剪接部位的两端设计引物进行RT-PCR扩增,分离扩增产物并测序。用RT-PCR检测NASG基因在鼻咽癌中的表达,采用了肿瘤表达谱阵列(cancerprofilingarray)杂交分析NASG基因在多种肿瘤组织的表达状况。结果:NASG基因3'UTR存在3种剪接产物,NASG基因在71%的鼻咽癌活检组织中表达下调,25%的肺癌组织中表达上调,而在其他肿瘤及其配对的正常组织未见明显表达。结论:NASG基因3'UTR存在3种剪接产物,NASG基因的表达异常是鼻咽癌和肺癌发生、发展过程中重要的分子事件。

瑞氏木霉EGⅠ3′-UTR对基因在酿酒酵母中表达的影响

将纤维素降解菌丝状真菌瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅰ (EGⅠ )全长cDNA克隆于酿酒酵母H1 58中得到表达。重组酿酒酵母产生的EGⅠ的最适pH值为 5 0 ,最适作用温度为 50℃～ 60℃。EGⅠcDNA中的 3′ 非翻译区 (3′ UTR)序列的删除导致EGI基因在酵母菌中没有活性产物表达。通过RT PCR技术检测EGⅠmRNA转录水平的结果表明 ,带有 3′ UTR的EGⅠcDNA在酿酒酵母中具有明显的转录产物生成 ,但删除 3′ UTR之后的EGⅠcDNA却检测不到转录产物。这说明EGⅠ的 3′ UTR对基因在酵母菌中的表达具有重要作用。

家鹅Myostatin基因3-′UTR序列分析

利用家鹅Myostatin基因第3外显子设计上游引物、家鸡Myostatin3-′UTR设计下游引物,PCR扩增并克隆出家鹅该基因3-′UTR长1 064bp DNA序列。该序列具有一个polyA加尾信号序列(TAATAAA),并富含连续的TTTT高保守区。分析家鹅与其他12个物种该序列的同源性发现,其与家鸡的同源性最高,达87.1%,与鱼类的最低(<11%)。以13个物种Myostatin3-′UTR构建的分子进化树表明,3′UTR能够为动物进化提供一定信息,但适用于较低分类阶元。

草鱼醛缩酶A3'-UTR突变与生长性状相关研究

采用直接测序法筛选草鱼(Ctenopharyngodon idella)醛缩酶A 3'-UTR突变位点,发现其转录终止密码子后58 bp处存在17 bp的插入片段。对草鱼养殖群体的插入突变进行分型,检测到该群体有AA、BB、AB三种基因型,等位基因B在群体中的频率为0.723,处于Hardy-weinberg平衡,多态信息含量是0.32,此突变在所测群体中属于中等遗传变异。利用一般线性模型分析基因型与草鱼群体生长性状(体重、体长、体高、体宽)的相关性,结果表明:醛缩酶A 3'-UTR突变与草鱼体宽和吻长2个生长性状达到显著相关(P<0.05),BB基因型个体比AA基因型个体的体重增加8.37%,在全长、体长、体高、尾柄长等生长性状也表现出比AA和AB基因型个体好。可将醛缩酶A 3'-UTR上的这段插入突变位点作为草鱼生长性状的候选分子标记用于草鱼的选育。

TNF-α3′-UTR双荧光素酶报告基因系统的构建及丹参酮类药物筛选

目的构建并鉴定p GL3-TNF-α3'端非翻译区(UTR)双荧光素酶报告基因(DLR)表达系统,以此基于调控TNF-α转录后水平对丹参酮类成分进行筛选。方法反转录人脐静脉内皮细胞HUVEC的mRNA成c DNA,以之为模板,PCR扩增含TNF-α3'-UTR的DNA片段全长,经酶切后连接至荧光素酶报告载体p GL3-control上,构建出p GL3-TNF-α3'UTR全长的荧光素酶报告基因载体并进行鉴定。将所构建的p GL3-TNF-α3'UTR与p SVRenilla质粒组成双荧光素酶报告系统共转染至单核巨噬细胞RAW264.7,经脂多糖诱导后利用该双荧光素酶报告基因表达系统判定丹参酮类成分对TNF-α转录后调控是否有影响。结果成功构建p GL3-TNF-α3'UTR荧光素酶报告基因,克隆获得的DNA片段大小及序列与Genbank报道的一致。脂多糖(LPS)可以明显诱导转入p GL3-TNF-α3'UTR载体细胞的荧光强度。丹参酮类成分中隐丹参酮可以明显降低LPS诱导的p GL3-TNF-α3'UTR载体细胞的荧光素酶活性。结论成功构建含TNF-α3'UTR区的双荧光素酶报告基因表达系统,并以此从丹参酮类化合物中筛选出隐丹参酮,可以对TNF-α的转录后水平进行抑制调控。

转录靶向猪瘟病毒3'-UTR shRNA细胞株的初步建立

利用质粒载体在细胞内转录并加工成siRNA的方法,设计3对针对猪瘟病毒3'-UTR不同位点的干扰片段,分别与干扰载体pGenesil-1连接,转化DH5α,筛选阳性克隆得到重组干扰质粒pGene-1,pGene-2和pGene-3,脂质体介导转染重组干扰质粒于PK-15细胞,G418抗性筛选得到转录靶向猪瘟病毒3'-UTR shRNA的PK-15细胞株,为今后应用RNAi研究猪瘟病毒3'-UTR调控病毒复制的功能以及抑制猪瘟病毒增殖的研究奠定了基础。

沙棘耐盐基因HrNHX1的克隆及3'UTR序列分析

以沙棘(Hippophae rhamnoides L.)叶片为材料,用改良SDS法提取总RNA,反转录合成第一链cDNA作为模板,根据已公布NHX1家族同源序列保守区设计简并引物,扩增出沙棘中HrNHX1基因的中间序列,然后用快速扩增cDNA末端(rapid amplification of cDNA end,RACE)方法,从沙棘中克隆到HrNHX13'cDNA序列。该序列(GenBank登录号:EU718492)长度为1373bp,与已知NHX1序列同源性最大为80%,其编码区1094bp,编码364个氨基酸,3'非翻译区(3'-untranslated region,3'UTR)长度为239 bp。3'UTR序列分析显示沙棘的3'UTR与陆地棉、葡萄柚和小盐芥的同源性分别为43.97%、45.63%和40.64%,明显低于编码区的同源性。结果表明,NHX1基因编码区具有较高的保守性,3'UTR序列的同源性较低,显示了非编码区在环境适应中的重要性,并为进一步研究沙棘对生境的适应分子机制奠定了基础。

5′UTR序列对DR5::GUS基因瞬时表达的影响

利用生长素响应原件(DR5)构建了DR5::GUS报告基因表达载体,并在载体构建时,对GUS的5′UTR序列进行2种设计:一种是利用载体GUS基因原有的5′UTR构建成pBI121-DR5::GUS;另一种采用植物增强表达的常用原件烟草花叶病毒(TMV)的5′端序列(Ω′)替换GUS基因原有的5′UTR序列,构建成pBI121-DR5(Ω′)::GUS。将2种载体转化根癌农杆菌后,采用烟草叶片注射浸染的瞬时表达检测法对2个载体的植物表达效果进行检测,2种载体分别转化烟草叶片2 d后,对浸染的叶盘进行GUS染色分析,pBI121-DR5::GUS的转化叶片有明显的GUS反应,而pBI121-DR5(Ω′)::GUS的转化叶片则无GUS反应。分离注射浸染部位叶盘RNA后,对GUS特异引物进行RT-PCR分析,2种转化的基因都已有效转录出RNA,但前者能翻译出相应的Ω-葡萄糖苷酸酶,后者则不能完成翻译过程,说明Ω′序列的引入并未有效提高GUS基因的表达,反而抑制了mRNA的翻译。

奶牛OLR1 3'UTR A223C多态的生物学信息分析

[目的]探索氧化型低密度脂蛋白受体OLR1 3'UTR A223C多态与奶牛乳脂率高低紧密关联的分子机制。[方法]用miRanda(1.0)软件装载牛microRNA数据库,预测OLR1 3'UTR潜在的microRNA。[结果]共预测16个microRNA靶标,OLR1 3'UTR A223C突变定位于bta-miR-370靶标种子序列的互补区。[结论]由于OLR1 3'UTR A→C突变导致bta-miR-370靶标的消失,为OLR1 3'UTR A223C多态与奶牛乳脂率高低紧密关联的分子机制深入研究提供依据。