高虫草素含量蛹虫草菌的复合诱变选育研究

蛹虫草菌是冬虫夏草的近缘种,简称蛹草,不仅含有种类齐全、含量比例适宜的人体必需氨基酸,还含有大量腺苷、虫草素、腺嘌呤,是食药两用的虫草属真菌。其中,虫草素具有抗菌消炎、抗病毒、抗肿瘤、抗癌等功效,是蛹草中重要的活性成分。不同蛹草菌产虫草素能力不同,本文采用LiCl、60Coγ复合诱变,对1株蛹草菌原始菌株进行诱变,考察了LiCl不同质量浓度、60Coγ射线不同辐照剂量对诱变菌株致死率、突变率的影响,并用高效液相色谱法对筛选出的稳定突变体发酵液中的虫草素含量进行测定,筛选出高产虫草素突变体1株,虫草素含量达2.64mg/mL,为蛹虫草菌的进一步改良提供了一定的参考依据。

^(60)Co-NTG复合诱变选育丁烯基多杀菌素高产菌株及其杀虫活性

为获得稳定高产的丁烯基多杀菌素生产菌株并明确其对农业害虫的杀灭效果,以前期研究获得的须糖多孢菌Saccharopolyspora pogona ASAGF19为初始菌株,通过^(60)Co-γ射线和亚硝基胍复合诱变得到1株遗传性状稳定的高产突变株ASAGF30A11,较初始菌株产量提高了61.26%,3次传代产量变化幅度小于10.00%。对高产菌株发酵液进行分离纯化获得了丁烯基多杀菌素粗品,配制成1.5 g/L浓度的母液进行稀释,对蓟马、蚜虫以及小菜蛾进行室内毒力测定,得出其对3种供试害虫的LC_(50)分别为1.92 mg/L、1.23 mg/L和0.27 mg/L。经过比较,丁烯基多杀菌素对蓟马的杀灭效果优于多杀菌素(LC_(50)为0.57 mg/L)和乙基多杀菌素(LC_(50)为0.64 mg/L);对蚜虫的杀灭效果优于多杀菌素(LC_(50)为72.60 mg/L),低于阿维菌素(LC_(50)为0.14 mg/L);对小菜蛾的杀灭效果优于多杀菌素(LC_(50)为2.87 mg/L),低于乙基多杀菌素(LC_(50)为0.05 mg/L)。本研究首次探索了^(60)Co-γ射线和亚硝基胍复合诱变对须糖多孢菌的影响,并获得了丁烯基多杀菌素对3种农业害虫的防效,为新型生物杀虫剂对农业害虫的防治提供了一些理论依据。

吡咯喹啉醌菌株复合诱变及其高通量筛选

以一株能产生吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone,PQQ)的细菌为原始菌株,首先通过紫外、微波和氯化锂单一诱变,然后再进行紫外⁃微波⁃氯化锂三者复合诱变处理。研究结果表明,紫外照射50 s、微波(350 W)照射60 s和氯化锂浓度为0.4%处理效果最佳,获得突变株C5Y⁃6⁃4,该菌株摇瓶产量达134.9 mg/L,是原始菌株的1.32倍。通过96孔板高通量筛选和高效液相色谱法检测,结果表明,采用复合诱变在一定程度上提高了吡咯喹啉醌的产量,且突变株C5Y⁃6⁃4遗传稳定性好。

多杀菌素生产菌的复合诱变选育及发酵优化

生物农药多杀菌素的发酵水平限制了其产业化发展。为了提高多杀菌素产量,以刺糖多孢菌T1(Saccharopolyspora spinose T1)为出发菌,通过常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)诱变和硫酸二乙酯(diethyl sulfate,DES)诱变,并以链霉素和鼠李糖作为筛选因子结合微孔板培养进行筛选,获得高产菌株S.spinosa F5;发酵后其多杀菌素产量为572.3 mg/L,比出发菌提高35.9%;通过单因素实验和响应面实验确定柠檬酸钠、异亮氨酸的最适添加量分别为0.46、0.10 g/L,豆油的最适添加体积分数为1.77%,此时多杀菌素产量为707.2 mg/L。在5 L发酵罐中进行分批发酵,发酵240 h产量接近800 mg/L;进一步分批补料发酵264 h,多杀菌素产量达1175.5 mg/L。结果表明,ARTP和DES复合诱变育种及添加外源诱导物可以显著提高多杀菌素产量。

高产酯酶格氏乳球菌的ARTP-UV复合诱变选育及发酵条件优化

以实验室前期筛选保藏的格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)S5-4为出发菌株,采用多轮次常压室温等离子体-紫外(ARTPUV)复合诱变对出发菌株S5-4进行诱变选育,以产酯酶酶活为评价指标,得到一株高产酯酶突变株ARUV3-26,其产酯酶活力达到(25.88±0.02)U/mL,较原始菌株S5-4提高了64.42%。经15代传代测试后,突变菌株ARUV3-26产酯酶活力稳定在(23.51±0.02)~(23.56±0.02)U/mL,与原始菌株S5-4相比提高了49.36%~49.68%。生理耐受性试验表明,突变株ARUV3-26与原始菌株S5-4相比,温度耐受性、pH耐受性、葡萄糖耐受性、乙醇耐受性、丁酸和己酸耐受性均有提升。通过单因素试验优化最佳培养基组分为:葡萄糖20 g/L,蛋白胨15 g/L,NaCl 5 g/L。通过单因素和响应面试验优化突变株ARUV3-26发酵条件为发酵时间3.0 d、发酵温度为30℃、初始pH值为7.0。此优化条件下,突变菌株ARUV3-26的产酯酶活力为(30.67±0.17)U/m L,比原始菌株S5-4的产酯酶能力提高了30.45%。

原生质体紫外-氯化锂复合诱变纳他霉素高产菌株的研究

本研究采用原生质体紫外-氯化锂复合诱变育种技术,以褐黄孢链霉菌为出发菌株,成功筛选出三株产纳他霉素能力较高且遗传稳定的突变菌株。实验发现,复合诱变最佳条件为氯化锂质量分数0.5%和紫外照射时间90 s,该条件下选出的三株产量较高的突变菌株,其摇瓶发酵液中纳他霉素平均产量为3 977 mg/L,较原始菌株提高32.5%。经连续五次传代后,突变菌株遗传性状稳定,且在300 L发酵罐中,SG-14突变菌株发酵液中纳他霉素产量最高,达4 176 mg/L,产量较出发菌株提升35.9%,周期缩短15 h。该育种技术显著提高生产菌发酵效率,对工业化生产和工艺改进具有重要价值。

玉米秸秆纤维素降解菌的紫外-微波复合诱变及产酶条件优化

目的筛选出降解性能更好的玉米秸秆纤维素降解菌株,为秸秆生物降解提供理论依据。方法利用刚果红染色法对菌株筛选分离并鉴定;通过复合诱变,获得降解性更好的菌株;采用单因素及正交试验测定不同条件下的羧甲基纤维素(CMC)酶活力和滤纸(FPA)酶活力,确定最佳产酶条件。结果经复合诱变获得1株降解性较好的菌株SF3-3,降解率比未诱变菌株提升18.12%,比单独诱变菌株提升10.84%;最适合产酶条件为温度28℃、pH值7.0、接种量2%、转速130 r/min。结论紫外-微波复合诱变能更好地提升菌株对秸秆的降解性能,最佳的产酶条件能够实现降解性能的进一步提升。

高产硝酸盐还原酶Staphylococcus simulans ZSJ6的复合诱变选育及其酶学性质研究

硝酸盐还原酶可以将天然肉制品中的硝酸盐还原为亚硝酸盐,避免了直接添加亚硝酸盐导致其含量骤增,降低产生亚硝胺的概率,对天然肉制品的品质和安全非常重要。以腊肠中筛选出的模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans D14)为出发菌株,探究了单一诱变条件包括紫外、微波、氯化锂诱变,以及紫外-微波-氯化锂联合诱变的两种复合诱变方式对菌株的不同影响,以期获得硝酸盐还原酶高产菌株,并通过摇瓶发酵初步探究其酶学性质,以期为天然肉制品的发酵剂提供菌株选择。确定了紫外、微波和氯化锂诱变的最佳条件:紫外照射60 s,微波辐照80 s,氯化锂浓度1.5%。筛选出诱变菌株Staphylococcus simulans ZSJ6,菌株酶活力可达603.29 U/mg蛋白,是出发菌株酶活力的3.59倍,且突变菌株连续传代8次后,其酶活力并无显著变化(P>0.05),表明其遗传稳定性较好。酶学性质结果显示,其最适作用温度为30℃,最适作用pH为7.5,且稳定性良好,在pH 7.5下孵育2 h,酶活力仍保留90%以上。Mg^(2+)、Ca^(2+)、K^+均能促进酶活力,其中Ca^(2+)对酶活力的促进作用最大,相对于空白组酶活力提升了1.63倍。Cu^(2+)、Fe^(2+)、Hg^(2+)、Mn^(2+)均能抑制酶活,其中Cu^(2+)和Hg^(2+)对酶活力的抑制作用最大,酶活力均被抑制到30%以下。研究结果为天然肉制品中硝酸盐的转化,以及生产初期使用亚硝酸盐带来的亚硝酸盐浓度过高等问题提供了解决思路,具有研究价值和应用潜力。

高产酯酶细菌的筛选、鉴定及复合诱变选育

该研究从大曲中筛选出高产酯酶的细菌,对其进行形态学鉴定和分子生物学鉴定,利用常压室温等离子体-紫外(ARTP-UV)复合诱变选育出优良突变株,并进行遗传稳定性试验,提高其产酶能力。结果表明,从某浓香型酒厂大曲中筛选出一株产酯酶酶活力为(13.73±0.04)U/m L的细菌,编号为S3-51,其被鉴定为少见鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)。对菌株S3-51进行ARTP-UV复合诱变,选育出酶活最高的突变株ARUV3-2,经遗传稳定性测试后,菌株ARUV3-2的酯酶酶活力稳定在(17.42±0.32)U/m L,相比于初筛时的产量提高了26.88%。菌株ARUV3-2为脂肪酸乙酯类化合物的工业合成和白酒质量的提升提供潜力。

ARTP-DES复合诱变结合前体耐受性选育达托霉素高产菌株

为提高玫瑰孢链霉菌AN-126的达托霉素产量,对菌株AN-126进行常压室温等离子体-硫酸二乙酯(ARTP-DES)复合诱变,并结合癸酸钠耐受性筛选,最终获得一株达托霉素高产菌株RR-447,摇瓶产量为(101.41±0.37)mg/L,是出发菌株的2.44倍。对高产菌株RR-447进行平板传代、菌落形态及BOX-PCR多态性分析。结果表明,高产菌株RR-447高产性能稳定遗传,与出发菌株的菌球形态有明显差异,且高产菌株RR-447基因组DNA在1.50~2.00 kb之间存在一条特异性条带。在5 L发酵罐中通过分阶段补加癸酸钠溶液评价了菌株RR-447的发酵性能,达托霉素产量达到512.64mg/L。ARTP-DES复合诱变结合癸酸钠耐受性是选育达托霉素高产菌株的一种有效育种手段,为达托霉素工业微生物育种以及其他菌株改良提供了技术参考。

亚硝基胍-紫外复合诱变选育高产衣康酸菌株

为提高土曲霉KYK-031发酵生产衣康酸能力,对出发菌株开展诱变育种和高产能力选育研究。采用亚硝基胍(NTG)和紫外(UV)复合诱变方法,通过平板初筛和摇瓶复筛,筛选衣康酸高产突变株。结果表明,亚硝基胍在500μg/mL浓度下的最佳诱变时间为40 min,15 W紫外诱变的最佳诱变时间为2 min,亚硝基胍-紫外复合诱变后筛选得到一株衣康酸高产菌株KYK-1035,摇瓶发酵产量为73.7 g/L,比出发菌株(41.8 g/L)提高了76.3%,糖酸转化率为63.4%。采用亚硝基胍-紫外复合诱变,提高了出发菌株诱变的正突变率,为衣康酸发酵继续放大和工业化生产奠定了基础。

诱变筛选Vc二步伴生菌

为了提高Vc二步发酵糖酸转化率,以巨大芽孢杆菌WS-05为出发菌株,采用微波和氯化锂复合诱变的方法进行诱变选育,筛选促进产酸菌生长和代谢的伴生菌。研究了微波-氯化锂诱变过程中不同的剂量、时间对Vc二步伴生菌存活率的影响,选取菌株存活率为55%~70%的3组诱变组合方式进行诱变,筛选能使小菌发酵产2-酮基-L-古龙酸产量高的伴生菌,经摇瓶发酵复筛,获得高产菌株D06,其转化率较出发菌株高2%。研究了发酵条件对新菌系的影响,结果显示:适当增加新菌系通气量(250 mL发酵摇瓶中装液20~25 mL)可以充分满足菌体代谢产酸对氧的要求,最适底糖浓度为7%,最适生长温度为31℃;经传代实验证明,其遗传性状稳定,4代平均转化率可达87.84%。

复合诱变选育高产虾青素的红法夫酵母菌株

以红法夫酵母野生型菌株(Phaffia rhodozyma 02)为原始出发菌株,依次进行2轮紫外(UV)-氯化锂(LiCl)和60Co-γ射线诱变,以40μmol/L二苯胺为抗性筛选剂,筛选得到1株遗传稳定的高产虾青素红法夫酵母突变菌株H4-4,命名为HSC-125,虾青素产量为25.36 mg/L,是原始出发菌株P.rhodozyma 02(4.75 mg/L)的5.34倍。采用2轮UV-LiCl和60Co-γ射线复合诱变结合二苯胺作为抗性筛选剂,选育得到的高产虾青素的红法夫酵母突变株,其遗传性质稳定,展现良好效果。

复合诱变原生质体选育重金属去除菌

选用紫外线和亚硝酸对产朊假丝酵母CR-001进行单因子和多因子诱变处理,通过复合诱变得到了6株具有高重金属抗性的高效重金属去除菌.经过传代后CRC2811-1和CRC7-2的抑菌圈直径减至1·7mm和1·2mm;对Cr6+的去除率分别从80·2%和81·2%提高到了95·2%和94·7%·其余4株突变株的抗性和除铬性能均可保持稳定·此外,利用扫描电镜、透射电镜和原子力显微镜等仪器对吸附铬前后细胞内外的变化情况进行分析,探讨了突变菌株除铬性能改善的机理·

曲酸生产菌的复合诱变选育

以黄曲霉 (Aspergillusflavus )为出发菌株 ,经 3次紫外线、 1次 60 Co、 3次亚硝基胍多重复合诱变处理 ,选育获得曲酸生产菌UCN7- 1 7,配以最佳培养条件 ,发酵 7d,曲酸产量由原来的 0 92 6% ,提高到 6 3%。实验证明采用多因子复合诱变 ,能有效改变菌株对诱变因素敏感性 ,提高变异率 。

氯化锂-紫外-离子束复合诱变红霉素高产菌株研究

以红霉素生产菌红色链霉菌为研究对象,探讨了氯化锂、紫外、离子束3种不同诱变方式对红色链霉菌的影响,根据后代的存活率和突变率选定合适的诱变条件:氯化锂的最优诱变浓度1.2%,紫外的最优诱变时间120s,离子束的最优诱变注量200×1014 cm-2,然后将3种方式结合起来进行复合诱变。经复合诱变后筛选获得高产突变株E0317-1-7-26,该菌株摇瓶效价达7 126μg/mL,较出发菌株E03提高了20.3%;经多次传代分离实验表明,该突变株遗传稳定性较好。

复合诱变选育酸性蛋白酶高产菌株

以米曲霉M-2为出发菌株,通过紫外线-氯化锂和硫酸二乙脂(DES)复合诱变,筛选酸性蛋白酶高产突变株,并进行固态发酵筛选试验。从大量突变株中进行筛选,获得1株遗传性稳定的酸性蛋白酶高产突变株D-7,其酶活力由出发菌的262.7U/g提高至602.5U/g,提高了129.3%。

豆豉发酵中的乳酸菌复合诱变及产酸条件优化

采用紫外和亚硝基胍复合诱变对筛选自豆豉的乳杆菌进行诱变处理,以期获得高产酸菌株。以最佳诱变条件筛选得到突变菌株的产酸度较原菌株提高了36.4%,且菌株能够保持较好的遗传稳定性。进一步利用响应面分析法对菌株产酸进行优化,并建立数学模型,得到最佳产酸条件为培养温度41.72℃、接种量3.65%(V/V)、培养时间18.57h。该条件下,产酸率模型的预测值为11.25°T/h,实际得到的产酸率值为11.2°T/h,预测值与实验值拟合良好。

He-Ne激光和亚硝基胍复合诱变米曲霉提高其蛋白酶和淀粉酶酶活力

以分离自豆酱中的米曲霉(Aspergillus oryzae)HDF-C14为出发菌株,采用He-Ne激光和亚硝基胍复合诱变的方法获得高产蛋白酶和淀粉酶的突变株HDF-C14-HN5,并将其应用到豆酱发酵中,测定酱曲发酵时蛋白酶和淀粉酶的酶活力。所得成曲中干基蛋白酶酶活力最高可达1572.64U/g,淀粉酶酶活力最高可达2815.23U/g。此生产性发酵实验可以为该菌株投入工业化生产提供技术支撑。

雨生红球藻的紫外、激光复合诱变育种

用紫外线和激光复合诱变生产虾青素的雨生红球藻 ,以适宜条件下的生长速率和亚适宜条件下的虾青素累积能力为筛选指标。结果表明 ,与原始出发株比 ,紫外线诱变后 ,色素累积速率提高 37.8% ,但生长速率有所下降。紫外线 ,激光复合诱变结果 ,生长速率提高 1 1 .1 % ,培养 1个月时虾青素累积量提高 52 .2 %。电镜观察结果表明 ,激光可刺激叶绿体发育 ,从而改善了紫外线诱变后的生长抑制状况 ,展示复合诱变是筛选高产虾青素藻株的有效方法。