大黄鱼ubc9基因的克隆和组织表达

类泛素化(sumoylation)是一种重要的转录后修饰过程。激活的SUMO(small ubiquitin-related modifer)和E2结合酶结合稳定后共价结合到底物上,从而完成对底物的类泛素化。UBC9(ubiquitin-conjugating enzyme)作为惟一的E2结合酶,在完成类泛素化中起着重要作用。从已构建的大黄鱼性腺线性化cDNA文库中筛选出ubc9同源片段,用SMART-RACE方法克隆得到了846bp的全长cDNA序列。该序列编码一个由158个氨基酸组成的蛋白。该蛋白序列与已知的UBC9高度同源,含UBC保守结构域和UBC9激活位点区域。实时定量PCR分析ubc9基因在各组织器官的表达,结果发现,ubc9基因在大黄鱼的性腺中大量表达。推测UBC9在大黄鱼性腺发育中起重要的生物学作用。

真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9的构建及表达

目的:克隆人类Ubc9基因cDNA全长,构建Ubc9的真核表达载体并表达。方法:采用RT-PCR技术从人小细胞肺癌NCI-H446细胞总RNA中扩增Ubc9 cDNA基因片段,经过酶切鉴定后,克隆至pUCM-T载体,测序证实碱基序列无误后,再克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体(pEGFP-N1)上,并转染到真核细胞,观察其在真核细胞中的表达。结果:测序证实克隆的Ubc9全长cDNA阅读框正确完整,酶切和序列测定证实Ubc9正确插入pEGFP-N1载体中,该重组载体能够在真核细胞中表达。结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9。

泛素结合酶9通过核因子κB通路诱导胃癌细胞SGC7901凋亡的研究

目的:研究泛素结合酶9(Ubc9)通过核因子κB(NF-κB)通路诱导胃癌细胞SGC7901凋亡的影响。方法:采用Ubc9基因的质粒对胃癌SGC7901细胞株进行瞬时转染,将实验对象分为:正常胃癌细胞A组(Normal组),脂质体B组(Lipo-2000组),空载质粒C组(NC-shRNA组),及目的质粒D组(Ubc9-shRNA组)。采用qRT-PCR检测各组Ubc9 mRNA水平,Western blot检测各组Ubc9、α-SMA、IKBα、p65与Bcl-2蛋白表达结果,流式细胞仪检测各组细胞周期与凋亡结果。结果:与各组比较,Ubc9-shRNA组转染后细胞凋亡增加,差异有统计学意义(P<0.05);Ubc9-shRNA组能显著的抑制胃癌SGC7901中Ubc9基因的表达,差异有统计学意义(P<0.05);Ubc9-shRNA组明显抑制SGC7901细胞中Ubc9蛋白、α-SMA和p65、Bcl-2蛋白表达,促进IKBα表达量的增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:Ubc9可能通过影响NF-κB通路下游凋亡基因从而参与胃癌细胞的凋亡。

Pmscv-Ubc9逆转录病毒表达载体的构建及产毒细胞系的建立(英文)

目的:构建含Ubc9的逆转录病毒表达载体,筛选建立携带该基因的高滴度产毒细胞系,深入研究SUMO化修饰的作用。方法:聚合酶链反应(PCR)扩增获取目的基因Ubc9,定向插入逆转录病毒表达载体pMSCVneo,形成重组质粒pMSCV-Ubc9;脂质体法将pMSCV-Ubc9转染逆转录病毒包装细胞PT67;G418筛选产毒细胞克隆,扩大培养产毒细胞克隆,收获病毒感染NIH3T3细胞。结果:限制性酶切和测序鉴定证实Ubc9正确插入逆转录病毒表达载体。G418筛选获得稳定产毒的抗性细胞克隆,收获病毒能有效感染NIH3T3细胞。结论:携带Ubc9基因的重组逆转录病毒表达载体pMSCV-Ubc9构建成功,转染PT67细胞后包装出重组逆转录病毒,进而筛选获得了能转录表达Ubc9的产毒细胞系PT67-Ubc9。

白念珠菌SUMO结合酶UBC9基因缺失株的构建及其在形态调控中的作用研究

目的构建白念珠菌UBC9基因缺失株,探索UBC9基因缺失对细胞形态转换和生物被膜形成的影响。方法采用瞬时CRISPR/Cas9基因敲除系统,分别于体外扩增Cas9基因、sgRNA以及修复DNA,通过醋酸锂法转化白念珠菌野生型菌株SN148,于SD-His选择培养基筛选转化子,通过菌落PCR验证基因型,构建UBC9双等位基因缺失株。分别检测UBC9缺失株在液体培养基中的细胞形态、固体YPD平板上的菌落形态和浸入生长情况以及生物被膜形成能力。结果PCR检测发现UBC9双等位基因缺失株中能扩出约2.8 kb的单一条带,UBC9基因缺失导致液体培养基中细胞伸长主要以菌丝态形式存在,固体培养基上菌落表面粗糙且深入到培养基内呈典型的浸入生长,并且生物被膜形成能力显著增高(A值为10.31,约为野生型的10.3倍)。结论利用CRISPR/Cas9系统快速构建了白念珠菌UBC9纯合子缺失株,且证明UBC9参与细胞的形态调控和生物被膜形成。