冬凌草甲素通过调控UBC9表达对肝星状细胞增殖、凋亡的影响

目的探讨冬凌草甲素对肝星状细胞增殖、凋亡的影响和分子机制。方法采用不同浓度的冬凌草甲素干预肝星状细胞(HSC-T6)48 h。分别采用噻唑蓝(MTT)实验、流式细胞术检测HSC-T6细胞增殖和凋亡变化。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白质印记(Western blot)检测泛素结合酶9(UBC9)表达变化。转染UBC9小干扰RNA(si-UBC9)下调HSC-T6细胞中UBC9表达水平,采用上述方法检测细胞增殖、凋亡变化。结果冬凌草甲素干预后,HSC-T6细胞增殖抑制率、凋亡率显著升高,UBC9表达显著降低,并具有显著的剂量依赖关系(P<0.05)。干扰UBC9表达后HSC-T6细胞增殖抑制率、凋亡率显著升高,UBC9表达显著降低(P<0.05)。过表达UBC9能够逆转冬凌草甲素对HSC-T6细胞的增殖、凋亡的影响(P<0.05)。结论冬凌草甲素能够抑制肝星状细胞增殖,诱导细胞凋亡,其机制与下调UBC9表达有关。

Ubc9在结直肠癌中的表达及其与化疗药物敏感性之间的关系

目的:研究小泛素相关修饰物泛素结合酶9(Ubc9)在结直肠癌中的表达及其与化疗药物敏感性之间的关系。方法:收集手术切除的结直肠癌及癌旁新鲜标本50例,腺瘤30例,免疫组化法检测Ubc9蛋白的表达,分析其表达与患者临床病理资料的关系。原代培养结直肠癌细胞,MTT法检测不同结直肠癌组织对顺铂及5-氟尿嘧啶的药物敏感性,分析Ubc9蛋白的表达与药物敏感性之间的关系。结果:Ubc9在结直肠癌中的表达均显著高于癌旁和腺瘤组织,差异均有统计学意义(P<0.05);Ubc9蛋白的表达与患者的性别、年龄及分化程度均无关(P>0.05),与肿瘤的TNM分期及淋巴结转移均有关(P<0.05);Ubc9蛋白的高表达与顺铂的耐药呈正相关(r=0.323,P<0.05),Ubc9蛋白的表达与5-氟尿嘧啶药物敏感性无显著相关性(r=0.283,P>0.05)。结论:Ubc9蛋白在结直肠癌中高表达,与患者的临床分期、淋巴结转移有关,与顺铂的耐药性呈正相关。

EGCG对A549细胞炎性反应模型UBC9表达的影响

目的观察泛素连接酶9(ubiquitin conjugating enzyme 9,UBC9)在表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)作用的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导A549细胞中的表达,探讨UBC9与EGCG抗炎性反应机制的相关性。方法根据筛选结果随机分为对照组、EGCG组、LPS组、EGCG+LPS组4个组,MTT检测不同浓度的EGCG(50~400μg/ml)和LPS(10~50μg/ml)对A549细胞增殖活性的影响,筛选最佳作用浓度,进一步通过免疫组化染色法、蛋白质印迹法和Realtime-PCR检测分析各处理组UBC9蛋白及其mRNA的相对表达量。结果 MTT显示,200μg/ml的EGCG细胞增殖抑制作用最强(F=1618.18,P<0.001),LPS 25μg/ml细胞增殖活性最明显(F=237.38,P<0.001)。免疫组化与蛋白质印迹检测均显示,与对照组比较,EGCG下调A549细胞UBC9蛋白表达(P<0.001),LPS则上调UBC9表达量(P<0.001),与LPS组比较,EGCG+LPS组UBC9蛋白表达明显降低(P<0.001)。同样,Realtime-PCR显示,与对照组比较,EGCG组UBC9 mRNA表达下调(F=89.34,P<0.001),LPS组UBC9 mRNA表达上调(F=225.00,P<0.001),与LPS组比较,EGCG+LPS组UBC9mRNA的表达受到抑制,显著降低(F=625.00,P<0.001)。结论 EGCG下调LPS刺激的炎性反应模型的UBC9的表达,其抗炎机制可能与抑制UBC9蛋白与mRNA表达有关。

人泛素结合酶9的原核表达与纯化

目的:表达和纯化高纯度的人泛素结合酶9(hUBC9)。方法:将hUBC9基因克隆到原核表达载体pGEX-6p-1上并转化大肠杆菌BL21(DE3),于30℃、1mmol/LIPTG诱导4h,表达GST-hUBC9融合蛋白。用Glutathione-Sepharose4B柱分离GST-hUBC9融合蛋白,用鼻病毒3C蛋白水解酶切去GST-hUBC9融合蛋白的GST标签,再用FPLC分子筛层析法进一步纯化hUBC9。结果和结论:获得了重组表达质粒GST-hUBC9并在大肠杆菌中可溶性表达,经亲和层析、酶切、分子筛层析后获得了可溶的、高纯度的hUBC9,为进一步研究hUBC9的功能和结构奠定了基础。

泛素结合酶9通过核因子κB通路诱导胃癌细胞SGC7901凋亡的研究

目的:研究泛素结合酶9(Ubc9)通过核因子κB(NF-κB)通路诱导胃癌细胞SGC7901凋亡的影响。方法:采用Ubc9基因的质粒对胃癌SGC7901细胞株进行瞬时转染,将实验对象分为:正常胃癌细胞A组(Normal组),脂质体B组(Lipo-2000组),空载质粒C组(NC-shRNA组),及目的质粒D组(Ubc9-shRNA组)。采用qRT-PCR检测各组Ubc9 mRNA水平,Western blot检测各组Ubc9、α-SMA、IKBα、p65与Bcl-2蛋白表达结果,流式细胞仪检测各组细胞周期与凋亡结果。结果:与各组比较,Ubc9-shRNA组转染后细胞凋亡增加,差异有统计学意义(P<0.05);Ubc9-shRNA组能显著的抑制胃癌SGC7901中Ubc9基因的表达,差异有统计学意义(P<0.05);Ubc9-shRNA组明显抑制SGC7901细胞中Ubc9蛋白、α-SMA和p65、Bcl-2蛋白表达,促进IKBα表达量的增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:Ubc9可能通过影响NF-κB通路下游凋亡基因从而参与胃癌细胞的凋亡。

SUMO化缺失对脓毒症小鼠树突状细胞功能的影响及其在脓毒症中的作用

目的:探讨类小泛素化修饰(small ubiquitin-like modifier,SUMO)缺失对脓毒症小鼠树突状细胞(dendritic cells,DC)功能的影响及其在脓毒症中的作用。方法:建立DC特异性的泛素结合酶9(ubiquitin-conjugating enzyme 9,UBC9)缺陷(UBC9^ΔDC)小鼠和野生型(wild type,WT)小鼠的阑尾结扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)脓毒症模型。计算并比较小鼠的7 d病死率;检测CLP术后24 h血液、肝和脾的细菌负荷;采用ELISA法检测CLP术后48 h小鼠血浆和骨髓来源树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells,BMDC)培养上清液中IL-1β,IL-6,IL-18和TNF-α水平以及小鼠脾单个核细胞培养上清液中IL-4和IFN-γ的水平;采用流式细胞术分析CLP术后48 h脾DC表面分子MHC Ⅱ,CD54和CD80的表达和脾单个核细胞中Th1,Th2细胞亚群的比例。结果:CLP术后,与WT脓毒症小鼠相比,UBC9^ΔDC脓毒症小鼠7 d病死率增加(P<0.05),血液(P<0.01)、肝(P<0.01)和脾(P<0.05)的细菌负荷增加;血浆和BMDC培养上清液中IL-1β和IL-18水平显著升高(均P<0.01);DC的数量、表面分子表达差异无统计学意义(均P>0.05);脾Th2细胞数量显著增加(P<0.05),Th1/Th2比值下调但差异无统计学意义(P>0.05),IL-4及IFN-γ水平均有升高且IFN-γ/IL-4比值显著下调(均P<0.05)。结论:SUMO化缺失可能通过DC调控炎症因子释放,异常活化T细胞,从而导致脓毒症小鼠死亡。

基于转录组测序分析宫颈病变中人乳头状瘤病毒16感染对泛素蛋白连接酶、核因子-κB表达的影响

目的探讨新疆妇女宫颈病变中Toll样受体9(TLR9)和泛素蛋白连接酶(UBC)、核因子-κB(NF-κB)表达与人乳头状瘤病毒16(HPV16)感染的关系。方法以人乳头瘤病毒(HPV)分型基因芯片检测86例慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变(CIN)和宫颈癌组织HPV感染及分型;Illumina Hiseq测序平台对15例宫颈病变组织进行转录组测序;通过免疫组化SP法检测TLR9、UBC和NF-κB在慢性宫颈炎、CINⅡ-Ⅲ和宫颈癌患者石蜡包埋组织中的表达水平。结果宫颈癌的HPV感染率为100%(41/41),CINⅡ-Ⅲ的感染率为60%(15/25),慢性宫颈炎的感染率为15%(3/20),其中HPV16为主要感染型别;转录组测序结果显示,HPV16阳性的宫颈癌和CINⅡ-Ⅲ组织中与TLR9相关的差异上调表达的基因有12个(NF-κB、UBC、TICAM1、POU2F3、S100A8、NOD2、CDK1、FOS、JUN、MAL、IRF7和RP11-58O9.2);免疫组化结果显示TLR9、UBC和NF-κB在CIN和宫颈癌组织中高表达,其表达水平呈正相关(r分别为0.510和0.469,P值均<0.001)。结论在宫颈癌发展过程中,HPV16感染可能通过泛素-蛋白酶体降解途径影响TLR9蛋白表达,具体调控机制需要深入研究。