泛素结合酶E2-EPF高表达质粒的构建及对绒癌细胞JEG-3生长功能的初步探讨

目的:构建泛素结合酶E2-EPF高表达质粒,初步探讨E2-EPF在绒癌细胞增殖中的作用。方法:基因克隆技术构建pcDNA(3.1+)-E2-EPF高表达质粒,通过瞬时转染将质粒导入绒癌细胞JEG-3中,使E2-EPF高表达;流式细胞仪检测及细胞增殖实验初步研究E2-EPF高表达对绒癌细胞生长速率的影响。结果:E2-EPF高表达质粒构建成功,瞬时转染后细胞E2-EPFmRNA升高约8.4倍,JEG-3细胞的生长速率显著高于对照组(P<0.05),处于G2-M期和S期细胞显著增加。结论:E2-EPF参与细胞的生长调控,促进E2-EPF表达可以加速绒癌细胞JEG-3的生长速率。

松材线虫Bx-ubc-3基因克隆及泛素通路鉴定

泛素途径可以调节许多关键的细胞功能。为探究松材线虫中是否存在泛素途径以及泛素途径中的关键酶基因—泛素结合酶基因ubc3,构建松材线虫cDNA文库,并进行测序、ORF分析、同源性分析、系统发育树构建、蛋白相互作用预测和分子动力学模拟等工作。克隆到长度为957bp的Bx-ubc-3基因片段。随后的序列分析表明,其开放阅读框长度为738bp,编码245个氨基酸;氨基6酸同源性分析结果表明,Bx-UBC-3与已知的泛素结合酶高度同源;蛋白互作和分子对接分析及分子动力学模拟结果表明,Bx-UBC-3的结合位点位于一个α螺旋、一个Loop1(L1)环与一个Loop2(L2)环;形成硫酯的Cys103位于L2上,构成催化裂隙;Bx-UBC-3和Bx-Rbx1之间以及Bx-UBC-3和Bx-泛素之间形成氢键。这些结果表明松材线虫中存在一条理论泛素通路,其中的关键酶Bx-UBC-3是开发高效抗线虫生物药剂的潜在靶标。

RIPK3基因转染的SH-SY5Y细胞中HIF-1α基因及其信号通路相关基因表达变化

目的观察受体相互作用蛋白激酶3(RIPK3)基因转染的神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y中低氧诱导因子1α(HIF-1α)mRNA及其信号通路相关基因表达变化。方法构建表达RIPK3基因的p CMV6-AC-GFP质粒(重组质粒),培养SH-SY5Y细胞,分为实验组及对照组,分别转染重组质粒和空载质粒。采用Western blotting法检测细胞中的RIPK3蛋白,分别于培养8、14、20、26、32、38 h后,通过MTT实验检测细胞增殖情况(OD值)。采用转录组测序技术(RNAseq)及Ingenuity Pathway Analysis(IPA)软件检测并筛选RIPK3-HIF1α下游信号通路中的关键基因。采用微滴式数字PCR(dd PCR)检测两组细胞中的HIF-1αmRNA。结果实验组细胞中RIPK3蛋白相对表达量(0.806±0.097 5)高于对照组(0.455±0.088 6),P<0.05。随培养时间延长,实验组细胞增殖受到抑制。实验组细胞中HIF-1αmRNA相对表达量(0.015 43±0.003 47)低于对照组(0.046 28±0.010 26),P<0.05。在HIF-1α为核心的相互作用关系网络中,筛选出关键分子泛素缀合酶样蛋白(UBC)、希佩尔-林道蛋白(VHL)、转录延伸因子B多肽1(TCEB1)、血管内皮生长因子A(VEGFA)。结论 RIPK3基因转染SH-SY5Y后,细胞中HIF-1αmRNA表达下调,同时HIF-1α信号通路相关基因(UBC、VHL、TCEB1、VEGFA)的表达水平受到影响。

可可泛素结合酶基因家族的生物信息学初步分析

泛素结合酶（E2s）促进底物泛素化或者与E3s链接,是靶蛋白泛素化的关键酶,在泛素-蛋白酶体途径中起重要作用。利用可可（Theobroma cacao L.）全基因组测序数据,共鉴定出45个E2s基因家族成员,包括39个UBC和6个UEV基因。通过生物信息学方法,对可可E2s家族的基本理化性质、基因结构、二级结构预测、亚细胞定位、进化关系等方面进行初步分析。结果表明：可可E2s基因CDS长度在441（Tc UEV3）～3 651 bp（Tc UBC7）之间,对应的编码蛋白氨基酸数目在146（Tc UEV3）～1 216 aa（Tc UBC7）之间,编码蛋白分子量在16.39～134.71 ku之间。E2s基因外显子在1～11之间,多数基因外显子数目在5～7之间。E2s基因在10条染色体上均有分布,1号染色体为7个,数量最多;6号染色体2个基因,数量最少。可可E2s蛋白大多为不稳定蛋白,且均为亲水性蛋白,其二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主要构成元件。大多数可可E2s蛋白定位在细胞核,少数定位在内质网或者细胞质。进化树分析表明：可可E2s蛋白被分为20个亚家族,包括16个UBC亚家族和4个UEV亚家族,第Ⅵ亚家族E2s数目最多为9个;E2s家族蛋白在物种进化过程中具有高度保守性。

大豆E2泛素结合酶基因GmUBC1的克隆及在拟南芥中的异源表达

E2泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzyme)参与植物的抗逆、生长发育等多种生物途径的调控,其功能研究在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的报道较多,但在重要经济作物大豆(Glycine max)中鲜有报道。本研究从大豆“南农94-16”中克隆了1个与大豆子叶折叠突变体可能相关的基因Glyma.12G161200,序列分析结果表明该基因编码一个E2泛素结合酶,因此将其命名为GmUBC1。该基因编码区全长为462 bp,编码一个含153个氨基酸的蛋白,预测其分子量为17.25 kDa,等电点为6.74。利用qRT-PCR技术对GmUBC1在大豆不同组织中的表达模式及其对不同非生物胁迫和激素处理的响应模式进行分析,发现该基因在开花后40 d种子中表达量最高,在PEG、低温、JA和ABA处理下表达下调。亚细胞定位分析发现GmUBC1蛋白在整个细胞内都有表达。进一步在拟南芥中异源表达GmUBC1,发现转基因株系的千粒重和总氨基酸含量显著提高,表明异源过表达GmUBC1可以调控种子重量和氨基酸含量,为大豆品质改良提供了基因资源。

水稻泛素缀合酶样蛋白基因OsCROC-1A的克隆与表达分析

为研究水稻泛素缀合酶样蛋白的序列特征、基因表达模式及亚细胞定位模式,采用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR),从水稻日本晴中鉴定并分离到1个泛素缀合酶样蛋白基因即OsCROC-1A的开放阅读框.序列分析结果表明,该基因编码1个具有146个氨基酸的蛋白质,含UBC保守功能域和催化位点D.比对分析结果表明,OsCROC-1A蛋白与其他CROC-1蛋白之间具有很高的相似性(42.61%～84.14%).聚类分析结果也显示出良好的物种属性.实时荧光定量PCR分析结果表明,OsCROC-1A在水稻各组织中均有表达,其中,在叶片、根、外稃中的表达量相对较高,在内稃、茎、雌蕊、愈伤组织中的表达量次之,而在雄蕊中的表达量相对最低.经4℃低温、20mmol/L H2O2、0.01%甲基磺酸甲酯等胁迫处理使胚性愈伤中的OsCROC-1A表达量显著上调,经300mmol/L甘露醇、100μmol/L脱落酸、200mmol/L NaCl胁迫处理则使愈伤组织中的OsCROC-1A表达量降低.OsCROC-1A与EGFP的融合蛋白表达于细胞质及细胞核中.这些结果为进一步研究该基因的生物学功能及其调控机制奠定了基础.

蓖麻E2基因家族鉴定及生物信息学分析

泛素蛋白酶体途径(Ubiquitin proteasome pathway)能使蛋白质选择性降解,在植物生长发育过程中起着非常重要的作用.泛素结合酶(Ubiquitin-conjugating enzyme,UBC)E2是该途径中一种非常重要的酶,在植物遭受非生物胁迫时起重要作用.目前,已在12种植物中鉴定了E2基因家族,但在植物蓖麻中E2基因家族的系统鉴定与分析鲜见报道.为揭示蓖麻E2家族的功能,本研究运用生物信息学方法鉴定得到33个泛素结合酶的家族基因,对其理化性质、蛋白结构及系统进化等进行分析.结果表明,蛋白质的氨基酸长度在102~568 aa之间;RcUBC蛋白的分子量范围为11.29812~62.93183 MW·KD-1;等电点介于4.34~9.47之间;不稳定系数范围为25.93~73.04;大部分蛋白无跨膜结构;脂肪系数在62.30~92.55之间;33个蛋白质的亲水性数值皆为负值,属于亲水性蛋白;二级结构主要组成部分是α-螺旋和无规则卷曲,延伸链次之,β-转角占很小的一部分;蓖麻RcUBC蛋白定位于多个细胞器可反映出RcUBC基因家族功能的多样性;根据进化树分析,RcUBC被分为4个亚家族,且同一亚家族的成员具有相似特性;对蓖麻RcUBC基因家族的33个蛋白序列进行比对分析发现Motif 1保守基序有很高的保守性.本研究可为蓖麻RcUBC基因家族功能的进一步研究提供参考.

氢醌对人L-02肝细胞泛素结合酶Rad6B表达的影响

目的研究氢醌(HQ)对人L-02肝细胞中泛素结合酶Rad6B表达的影响。方法将L-02肝细胞用不同浓度(0、5、10、20、40、80和160μmol/L)的HQ处理24h之后,采用实时荧光定量PCR技术检测Rad6B在mRNA水平上的表达;采用Western blot方法检测Rad6B在蛋白质水平上的表达。结果在0～160μmol/L的范围内,HQ可诱导Rad6B在mRNA和蛋白质水平上表达的增加,具有随着剂量的增加而升高的趋势;并且各染毒剂量组(5、10、20、40、80和160μmol/L组)肝细胞Rad6B在mRNA和蛋白质水平上的表达均明显地高于对照组(0μmol/L组)(P<0.01);当HQ的作用浓度达到160μmol/L时,Rad6B的表达水平达到最大值,其mRNA和蛋白质表达的相对定量值分别为4.35和0.85。结论HQ可使L-02肝细胞的Rad6B表达增加。

UbcH7在癌症治疗中的研究进展

作为泛素交联酶(ubiquitin-conjugating enzyme)E2家族的一员,泛素交联酶L3(ubiquitin conjugating enzyme L3,Ubc H7)具有联合泛素连接酶(ubiquitin ligase)E3对底物蛋白进行泛素化修饰的功能。Ubc H7参与了p53结合蛋白1(p53 binding protein,53BP1)的泛素化修饰及蛋白酶体途径降解,Ubc H7缺乏抑制53BP1的降解,使细胞选择易错方式修复DNA损伤,并导致高效的细胞死亡。因此,对Ubc H7的功能进行抑制,可有效地增强癌症细胞对放射性治疗和DNA损伤类化疗药物的敏感性以及对抗肿瘤的放化疗耐受。Ubc H7有望成为一个理想的潜在癌症治疗靶点。