人脐带间充质干细胞制备工艺研究

建立人脐带间充质干细胞标准化的制备工艺。比较不同培养基、消化液及消化时间处理人脐带间充质干细胞的增殖水平、表型、分化功能;设计不同细胞接种密度及汇合度进行培养,观察细胞生长状态并计算细胞倍增时间。人脐带间充质干细胞在MSC-T4培养基中,CTS消化酶消化3 min表现出更佳的增殖水平、间充质干细胞表型、成骨、成脂的能力;10000 cells/cm^(2)和8000 cells/cm^(2)的细胞接种密度分别是最合适的人脐带间充质干细胞复苏接种密度和传代接种密度;90%~95%汇合度为人脐带间充质干细胞传代最佳汇合度。

奶牛脐带间充质干细胞的体外培养与鉴定

【目的】在无菌环境下截取新生牛脐带20 cm,在体外进行原代奶牛脐带间充质干细胞分离培养,建立原代奶牛脐带间充质干细胞分离、培养、传代的方法,并进行形态学观察和多向分化能力检测。【方法】采用多重酶混合消化法,分离出原代奶牛脐带间充质干细胞,通过倒置显微镜下观察细胞形态,绘制细胞生长曲线,向成脂、成骨诱导分化。【结果】培养出了奶牛脐带间充质干细胞。倒置显微镜下观察,细胞形态呈相对均一的梭形,平行排列生长或呈旋涡状生长。能够诱导分化为成脂、成骨细胞。细胞增殖能力强,可多次传代。【结论】胰酶消化法能够快速分离出原代奶牛脐带间充质干细胞,所获得的细胞纯度较高,具有一般间充质干细胞的生物学特性,具有多向分化潜能。

脐带间充质干细胞染色体核型制备及安全评估

目的探讨脐带间充质干细胞染色体核型制备方法,评估脐带间充质干细胞安全性。方法对培养至第2、5、8、10、11代的共15例脐带间充质干细胞进行染色体制备,检查其有无异常。结果成功制备染色体标本,成功率为100%,正常核型率为100%。结论该脐带间充质干细胞染色体制备方法实验结果稳定、成功率高。脐带间充质干细胞在培养至11代时未见异常染色体核型。

人脐带间充质干细胞的分离鉴定及其修复缺血缺氧脑损伤作用

目的:研究人脐带间充质干细胞(UCMSCs)多向分化潜能,了解UCMSCs移植治疗脑缺血缺氧损伤(HIBD)大鼠的神经修复功能。方法:采用组织消化原代贴壁法分离培养人UCMSCs;取第4和10代UCMSCs进行流式细胞术检测间充质干细胞(MSCs)表面特异标志物表达;染色体分型检测染色体是否畸变;进行成神经、骨、脂诱导,了解其多向分化潜能;制备HIBD大鼠模型,穿梭箱测试对照组、HIBD细胞移植组和HIBD组大鼠的主动逃避率(AARR)和未逃避率(NARR)。结果:流式细胞术结果显示,类似MSCs样细胞强表达CD29、CD44和CD105,极低表达CD34和CD45,符合UCMSCs的特征。多向分化诱导后的细胞染色和免疫荧光结果显示,UCMSCs可诱导分化为神经样细胞、脂肪细胞和成骨细胞,多次传代后仍可多向诱导,且未发生染色体畸变。穿梭箱测试提示,UCMSCs移植组大鼠在测试的第3、4和5天的AARR高于HIBD组(P<0.05)。结论:UCMSCs易获取及纯化,具有多向分化潜能,多次传代功能稳定,可改善脑损伤动物的神经功能。

脐血混合培养纯化人间充质干细胞及生物学特性研究

目的探讨体外分离、混合培养纯化人脐血间充质干细胞的适宜体系,观察该人脐血间充质干细胞生物学特性。方法收集孕足月新生儿脐血,每3份脐血[(70—100)ml/份]混合;采用1.077 g/ml的淋巴细胞分离液(Ficoll)以1 500 r/min密度梯度离心法分离脐血中的单个核细胞,在Mesencult培养基中贴壁培养筛选人脐血间充质干细胞,显微镜下观察细胞生长形态变化,细胞计数并绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞抗原表达,分析细胞周期;体外诱导脐血间充质干细胞成脂、成骨分化。结果密度梯度离心法所获得的单个核细胞,在培养基中培养约3—5 h开始出现贴壁生长,24 h后贴壁细胞增多,呈明显纺锤状,10 d后开始出现细胞克隆,3周后呈漩涡状生长。原代培养时间为15 d,P1代倍增时间为26 h。流式细胞仪鉴定:贴壁生长的细胞表达CD29、CD44和CD105,不表达CD34、CD45。分化潜能鉴定体外培养细胞可以成脂、成骨分化。结论所贴壁培养出的细胞的生长形态、流式表形、分化潜能具有人脐血间充质干细胞生物学特征,混合培养可以提高间充质干细胞培养成功率,实验中采用的培养体系适宜人脐血间充质干细胞的分离培养。

人脐带间充质干细胞致瘤性试验

目的:观察人脐带间充质干细胞对裸鼠的致瘤性。方法:培养扩增人脐带来源的间充质干细胞,制备成细胞生理盐水混悬液注射裸鼠。观察8周裸鼠体内有无肿瘤生长。结果:裸鼠注射细胞后无明显不适,8周观察期内裸鼠体内未见肿瘤生长,病理组织学检测未见异常。结论:人脐带间充质干细胞导致肿瘤发生的可能性低。

脐血间充质干细胞混合培养及临床实验研究

目的分析比较脐带血间质干细胞单份与双份混合培养细胞增殖诱导分化为神经样细胞及临床输注效果观察。方法应用Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液在多联袋中以密度梯度法无菌获取脐血单个核细胞,并检测CD133+细胞数。将制备的单个核细胞接种于含有B27和bFGF的DMEM/F12培养瓶中,置于37℃体积分数为5%CO2饱和湿度的培养箱内培养。当细胞培养3d时,随机取培养的6份脐血间充质干细胞(2/3量)为A组,6份脐血间充质干细胞(2/3量)为B组,将A、B组各剩余的1/3量脐血间充质干细胞混合为C组。3组细胞密度均调整为1.0×104/ml。以活细胞计数法比较3组细胞不同时间的扩增数量,免疫组织化学检测脐血间充质干细胞巢蛋白的表达,流式细胞仪检测分离后及培养10d后CD133+细胞数。将单份培养和混合培养7d的脐带血间充质干细胞分别经静脉输注入脑卒中后遗症患者体内,每次输注2份,每例患者平均输注6份,每份间隔时间平均4d。于治疗前和治疗3个月后评价患者神经功能状态、肢体运动功能及日常生活活动能力。结果活细胞计数检测显示,将2份不同脐血间充质干细胞混合后,细胞贴壁、增殖比单份脐血间充质干细胞快(P<0.05)。3组细胞经bF-GF诱导后均表达巢蛋白,表达率差异无统计学意义(P>0.05),流式细胞仪检测CD133+细胞数,结果显示A、B2组差异无统计学意义(P>0.05),而混合脐血MSCsC组与单份脐血MSCsA、B组差异均有统计学意义(P<0.05)。2组患者治疗前与治疗3个月后相比,神经功能状态、肢体运动功能及日常生活活动能力评分均明显升高(P<0.01),但治疗后2组之间无明显差异(P>0.05),均未发现免疫排斥及不良反应。结论混合培养时脐血间充质干细胞之间有互相促增殖作用,应用bFGF诱导的脐血间充质干细胞可以表达巢蛋白。

脐带间充质干细胞制剂的质量管理及有效性和安全性

在临床应用时,脐带间充质干细胞制剂的质量直接影响其安全性和有效性。在脐带间充质干细胞分离纯化、制剂制备、储存以及运输等环节,需要建立相应的质量标准、质量检测方法和质量管理流程,确保制剂中干细胞的数量、活性达到临床要求,并且不含有细菌、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病病毒、EB病毒、巨细胞病毒、人类嗜T淋巴细胞病毒、真菌、支原体、衣原体、梅毒螺旋体、寄生虫、内毒素等病原体以及其他未经批准用于临床的物质。脐带间充质干细胞可用于自身免疫性疾病、退行性疾病、衰老性疾病、遗传缺陷性疾病、放射性疾病、炎症、组织器官损伤等病症的治疗,并且具有明确的疗效。脐带间充质干细胞用于临床治疗是安全的,除极少数患者轻度腰部酸痛、头昏、头痛、发热外,无其他任何严重不良反应。但是,也有一些患者不宜进行脐带间充质干细胞治疗。

人脐带间充质干细胞来源工程化纳米囊泡的制备与鉴定

目的:探索来源于人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的工程化纳米囊泡(Nanovesicle,NVs)的制备与鉴定方法,为深入了解工程化NVs的生物学功能提供数据基础。方法:采用物理方式破碎hUC-MSCs以获取NVs,并采用改良的超速离心法进行分离和纯化;通过纳米颗粒跟踪分析(NTA)、透射电镜(TEM)观察、蛋白质免疫印迹(WB)及生物学活性分析方法鉴定NVs的特性。结果:建立的方法成功分离出NVs,TEM下观察到NVs呈中间凹陷的茶杯样结构;NTA结果显示NVs直径在100 nm左右;Western Blot实验证实NVs几乎不表达外泌体特异性蛋白TSG101;生物学活性实验表明NVs不能促进人皮肤成纤维(HSF)细胞增殖。结论:本研究建立的hUC-MSCs来源的NVs提取及鉴定方法可行,为NVs在未来的临床研究提供了数据基础。

提升间充质干细胞制剂保存稳定性的有效途径

脐带间充质干细胞能够应用于遗传缺陷性疾病、衰老性疾病、放射性疾病或组织器官损伤等一系列病症的治疗,在临床上具有显著的治疗效果,其稳定性将直接影响治疗的安全性和有效性。将脐带间充质干细胞制剂分别放置于室温(23℃)和4℃条件下,于0、2、4、6、8、10、12和24 h抽样,以探究提升脐带间充质干细胞制剂稳定性的条件,为其日后的保存、运输等环节提供科学的参考依据。

过表达促红细胞生成素脐带间充质干细胞抑制缺血缺氧SH-SY5Y细胞凋亡及机制

背景:前期研究成功构建过表达促红细胞生成素的脐带间充质干细胞(erythropoietin-overexpressed umbilical cord mesenchymal stem cells,EPO-MSCs),发现其可以显著减少缺血缺氧人神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y)细胞的凋亡。目的:探究EPO-MSCs对缺血缺氧SH-SY5Y细胞可能的神经保护机制及其相关表观遗传学机制。方法:用氧-葡萄糖剥夺法缺血缺氧诱导SH-SY5Y细胞损伤,分别与慢病毒转染空载质粒的脐带间充质干细胞(NC-MSCs)、EPO-MSCs共培养后进行转录组测序,根据组间差异基因进行相关分析。同时应用多因子法检测缺血缺氧性脑病患者和对照组脑脊液上清及共培养细胞上清炎性因子表达水平。蛋白组学检测NC-MSCs、EPO-MSCs差异表达蛋白。应用染色体靶向切割和标签化(CUT&Tag)测序技术检测基因组H3K4me2修饰情况,并与转录组测序联合分析。慢病毒载体感染构建稳定敲低REST的SH-SY5Y细胞,应用qRT-PCR、Western blot检测REST的表达水平,然后再缺血缺氧处理并与EPO-MSCs共培养,流式细胞仪检测细胞凋亡情况、Western blot检测H3K36me3组蛋白的表达差异,然后进行转录组测序分析差异表达基因。结果与结论:①与对照组比较,缺血缺氧性脑病患者脑脊液上清中单核细胞趋化蛋白1、白细胞介素6、白细胞介素18、白细胞介素1β、干扰素α2、白细胞介素23水平显著增加(P<0.01);②缺血缺氧SH-SY5Y细胞与EPO-MSCs共培养后单核细胞趋化蛋白1、白细胞介素6表达水平明显降低;③蛋白质网络相互作用分析发现单核细胞趋化蛋白1、白细胞介素6相关调控蛋白CXCL1、BGN等显著下调;④转录组测序分析发现EPO-MSCs组SH-SY5Y细胞中促炎基因较NC-MSCs组显著下调,组蛋白修饰的功能富集以及转录因子REST、TET3的表达显著上调;⑤转录组测序与CUT&Tag联合分析发现表观遗传水平变化以及转录因子REST和TET3启动子区域显著激活;⑥成功构建稳定敲低REST的SH-SY5Y细胞,REST mRNA转录水平和蛋白表达均降低;⑦缺血缺氧处理敲低REST的SH-SY5Y细胞与EPO-MSCs共培养后细胞凋亡显著增加、H3K36me3表达显著降低,转录组测序显示炎性相关基因Aldh1l2、Cth等以及凋亡抑制基因Mapk8ip1、Sod2在mRNA转录水平表达降低(P<0.01);⑧结果表明:EPO-MSCs通过分泌组的改变影响H3K4me2的峰度从而激活REST、TET3的表达,上调H3K36me3的修饰水平,进而调控炎性相关基因Aldh1l2、Cth等以及凋亡抑制基因Mapk8ip1、Sod2的表达,促进神经元的存活。

人脐带间充质干细胞传代后发生染色体核型变异

据文献报道人脐带间充质干细胞传代10次以上染色体核型分析都正常,我们在研究中发现,一例人脐带间充质干细胞传代到第8代,发生了染色体核型变异。现报道如下。

人脐带间充质干细胞诱导分化为Leydig细胞的研究

目的探讨以共培养技术诱导人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）向Leydig细胞分化的可行性，为儿童睾酮分泌不足的治疗奠定基础。方法用酶消化法分别分离获得hUCMSCs和小鼠Leydig细胞，用Transwell培养板隔离共培养诱导hUCMSCs向Leydig细胞分化，单纯hUCMSCs培养作为对照。诱导2周后，对诱导后细胞采用实时定量聚合酶链反应（Real—time PCR）及Western blot检测。结果细胞诱导2周后，Real—time PCR检测结果显示细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶（P450scc）、3β羟基类固醇脱氢酶（3β-HSD）、17β羟基类固醇脱氢酶（17β—HSD）、黄体生成素受体（LH，R）、促肾上腺皮质激素受体（ACTH—R）及21-羟化酶（P450c21）的mRNA呈阳性表达，而对照组呈阴性。Westernblot检测诱导后细胞，未发现Leydig细胞特异性酶的阳性表达。结论通过体外共培养，有可能将hUCMSCs诱导分化为Leydig细胞。