通用引物PCR方法在地表水病原菌检测中的应用

为了探索通用引物PCR方法在地表水病原细菌检测中的应用价值,利用16S rRNA基因的高度保守性,设计并合成细菌的通用引物,采用合成的引物扩增参考菌株及西安市区不同地表水样,并对PCR产物分别进行序列测定及序列同源性分析,同时检测水样中的细菌总数和粪大肠杆菌浓度.结果显示,通用引物扩增4种参考菌株,320 bp处均可得到清晰的电泳条带,其特异性通过序列测定及同源性分析得到进一步验证;通用引物PCR可检出250 ng/L的埃希氏大肠杆菌标准菌株DNA,其PCR检测的灵敏度可达0.275 CFU/mL;用通用引物对西安市区不同地表水样进行PCR扩增,其中河、兴庆湖、大唐芙蓉园北湖、北石桥污水处理厂出水样品320 bp处都得到了清晰的电泳条带,而黑河水样没有条带;与之相对应的粪大肠杆菌群检测结果显示,只有北石桥污水处理厂出水和兴庆湖水样有粪大肠杆菌检出.

环境水体中肠道病原细菌的定量PCR检测

采用通用引物,通过实时荧光定量PCR方法（QPCR）,对西安市5处地表水体中肠道病原细菌的细胞密度进行4个月的连续检测,并将QPCR检测结果与滤膜法测得的大肠菌群CFU值进行比较分析.结果显示,QPCR法可信度为94%,最小检测值为每管未稀释DNA提取物含2.7个大肠杆菌细胞.5个水体（N=60）检测结果表明,QPCR检测结果是大肠菌群CFU的2.2-5倍.病原细菌的几何平均值范围,QPCR法在25-67000 CCE/100 mL之间,MF法大肠菌群为3-45000 CFU/100 mL之间.2种方法的离散和回归分析表明,QPCR检测结果与大肠菌群CFU显著正相关,秩相关系数为r=0.983.

环境水体中肠道病原细菌定量PCR检测与膜过滤分析方法的比较

采用通用引物，通过实时荧光定量PCR方法（QPCR），对西安市5个地表水体中肠道病原细菌的细胞密度进行了分析．检测水样体积为100mL，分别于2006年3-6月取自水源水（黑河）、景观娱乐用水（大唐芙蓉园北湖和兴庆湖）、纳污河（泸河）和未消毒的二级出水（北石桥污水处理厂），并将QPCR检测结果与滤膜法（MF）测得的细菌总数、大肠菌群和粪大肠杆菌CFU结果进行了比较分析．5个水体（n=60）检测结果显示，QPCR检测结果是大肠菌群CFU的2，2-5倍，是粪大肠杆菌CFU的7-14倍．病原细菌检测的几何平均值范围，QPCR法在25-67000 CCE·100mL^-1之间，MF法大肠菌群在3-45000 CFU·100mL^-1之间，粪大肠菌群在0-3000 CFU·100mL^-1之间（n=60）．两种方法的检测结果使用Spearman秩相关法来计算，结果显示，QPCR检测结果与大肠菌群、细菌总数以及粪大肠杆菌CFU均呈现显著正相关，秩相关系数分别为r=0．983、r=0．908和r=0．948．

通用引物PCR检测临床常见致病菌的实验研究

通用引物可一次性扩增18种临床常见致病菌和耐药菌株的DNA,扩增片段长度在220bp左右,18种特异性探针分别与18种标准菌株的PCR扩增产物杂交结果显示探针都具有高度特异性;5种37例经法国梅里埃API细菌鉴定系统确定的临床分离菌株进行杂交鉴定,鉴定结果与分离株一致,表明设计的探针具有高度特异性及准确性。80例临床标本分别用法国梅里埃API细菌鉴定系统及PCR杂交法进行检测,阳性率分别为(52.5%)和(67.5%),表明PCR结合寡核苷酸杂交法比传统的生物学培养法更为灵敏,值得推广。

细菌16S rRNA基因实时荧光定量及分型方法的建立

目的细菌培养、组织学、免疫学及普通PCR方法等在病原菌的检测方面都存在一定的不足,不能满足临床的需要,探索快速可靠的败血症和化脓性脑膜炎等细菌性感染疾病诊断的新方法是目前亟待解决的关键问题。方法分析细菌16S rRNA基因序列,在高度保守区自行设计通用引物和探针,以及革兰阳性和阴性分型探针,对12种标准菌株、23种临床培养分离株、乙型肝炎病毒、新型隐球菌及白色念珠菌、人基因组DNA等进行了荧光定量检测,分析三种探针检测结果的相关性。结果细菌16S rRNA基因荧光定量PCR具有较好的敏感性和特异性,最低能检测到10个拷贝的16S rRNA基因,即相当于2个细菌,与病毒、真菌及人基因组DNA等无交叉阳性反应;12种标准菌株、23种临床培养分离株均进行三种探针的荧光定量检测:通用探针均为阳性,18株革兰阳性菌株通过革兰阳性探针(G+Probe探针)检测为阳性,17株革兰阴性菌株通过革兰阴性探针(G-Probe探针)检测为阳性,反之均为阴性,吻合率100%。结论建立了用通用引物和分型双荧光探针的细菌荧光定量PCR定量、分型方法。其检测方便,快速、敏感性和特异性高,符合率好,同时进行定量和分型,在病原菌检测方面具有推广及应用价值。

16SrRNA基因聚合酶链反应快速检测烧伤脓毒症细菌病原体的研究

目的为早期诊断烧伤脓毒症,探索一种能迅速检测细菌感染的方法。方法按标准收集可疑脓毒症患者39人外周静脉血标本共41份。将每份标本一分为二分别行血培养和用细菌通用引物行16SrRNA基因聚合酶链反应检测,用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物,比较两种方法在检测细菌病原体时的快速性和敏感性,分析血培养及药敏结果。结果16SrRNA基因PCR方法的阳性率(41.16%)是血培养阳性率(21.95%)的近两倍,P<0.05。16SrRNA基因PCR方法出结果需4、5h,血培养需12～24h(多数需2、3d)。9例血培养阳性患者中,8例为单一铜绿假单孢菌感染,1例为单一溶血链球菌感染。结论16SrRNA基因PCR检测细菌感染的方法具有特异性、快速性、敏感性的优点。在该中心,使用抗生素治疗后,引起脓毒症的细菌主要为铜绿假单孢菌,该菌对目前常用广谱抗生素耐药。