钩藤UrTSA基因克隆及组织表达特异性分析

【目的】克隆钩藤碱的合成关键酶即色氨酸合成酶α链基因(UrTSA),并分析其组织表达特异性,为探究该基因的钩藤碱生物合成机制提供理论参考。【方法】从生物项目数据库(BioProject)筛选得到钩藤碱的生物合成相关酶基因UrTSA,以钩藤的根、叶、茎钩和蒴果的cDNA为模板,PCR克隆UrTSA基因的开放阅读框(ORF),并进行生物信息学分析,结合实时荧光定量PCR检测UrTSA基因在钩藤不同组织中的表达模式。【结果】UrTSA基因的ORF为963bp,编码320个氨基酸残基,相对分子量为33924.49Da,理论等电点(pI)为9.11,不稳定指数Ⅰ为33.50,脂溶指数为102.12,总平均亲水性指数为0.117,说明UrTSA蛋白为稳定、脂溶性好的疏水蛋白。UrTSA蛋白亚细胞定位于叶绿体,不含信号肽和跨膜区,为非分泌型蛋白;不具有潜在的糖基化位点,有30个潜在的磷酸化位点,包括16个丝氨酸(Ser)、13个苏氨酸(Thr)和1个酪氨酸(Tyr);二级结构由α-螺旋(43.44%)、无规则卷曲(31.87%)、延伸链(15.94%)和β-折叠(8.75%)组成。UrTSA蛋白与其他11个植物物种的TSA蛋白具有较高的氨基酸序列相似性(69.78%~92.77%),其中与阿拉比卡咖啡(Coffeearabica)和欧基尼奥伊德斯种咖啡(Coffeaeugenioides)TSA蛋白的亲缘关系较近。UrTSA基因在钩藤的根、叶、茎钩和蒴果中均有表达,其中在蒴果、根和叶中相对表达量均极显著高于茎钩中的相对表达量(P<0.01),分别是茎钩的2.17、1.58和1.20倍。【结论】UrTSA基因具有组织表达特异性,主要在蒴果钩藤碱合成中发挥调控作用,为后续研究钩藤碱在钩藤中不同部位的累积及其生物合成途径提供思路和线索。