Biochemical Characterization of Uracil-DNA Glycosylase from Pyrococcus furiosus

We report the characterization of a uracil-DNA glycosylase（UDG） from the hyperthermophilic archaea Pyrococcus furiosus（P, furiosus）. P. furiosus UDG（PfUDG） has high sequence similarity to the families IV and V UDGs（thermostable UDG family and PaUDG-b family）. PfUDG excises uracil from various DNA substrates with the following order： U/T=U/C〉U/G=U/AP=U/-〉U/U=U/I=U/A. The optimal temperature and pH value for uracil exci- sion by PfUDG are 70 ℃ and 9.0, respectively. The removal of U is inhibited by the divalent ions of Fe, Ca, Zn, Cu, Co, Ni and Mn, as well as a high concentration of NaC1. The phosphorothioates near uracil strongly inhibit the exci- sion of uracil by PfUDG. Interestingly, pfuDNA（Pyrococcusfuriosus DNA） polymerase, which tightly binds the ura- cil-carrying oligonucleotide, does not inhibit the excision by Pfl.IDG, suggesting PfUDG in vivo functions as the re- pair enzyme to excise uracil damage in genome.

稳定剂保护PCR扩增dU-DNA效果研究

目的 :了解 94℃灭活UDG与不灭活及扩增产物加稳定剂与不加稳定剂对DNA杂交效率的影响。方法 :采用微孔板DNA杂交技术检测PCR扩增dU -DNA杂交效果。以不加UDG组DNA杂交A值为对照、计算杂交百分率。结果 :不加UDG组扩增前后未经 94℃灭活处理 - 2 0℃保存 2 0h杂交效率为 90 .2 93% ,加UDG组在 4℃、室温、37℃放置 2 0h ,杂交效率为 2 0 .15 % ,2 1.37% ,2 9.37%。加UDG并增加 94℃灭活步骤、37℃水浴放置 2 0h ,杂交效率为 73.5 7% ,78.82 %。在此基础上加入稳定剂 37℃水浴 4 3h杂交效率达到 99.88%～ 10 0 %。 37℃水浴 6 7h杂交效率仍达到 86 .0 6 %～ 97.10 %。结论 :上述结果证实用于抗污染时 ,扩增前后增设 94℃灭活 10min可提高杂交效率。加入稳定剂可使杂交A值 1.80达到对照组A值 1.81水平。提示稳定剂对保护PCR扩增dU -DNA有极其重要作用。

抗污染扩增试剂在法医物证检验中的应用

客观、准确的法医遗传检验结果是作出准确鉴定意见的基础。随着检验设备、扩增检测试剂检验灵敏度日益增加,防控实验室污染、样品污染的压力与日俱增,其中PCR扩增产物对检测结果的污染最难防控。本文测试一款抗污染扩增试剂盒NH-18A,该试剂盒包含16个常染色体STR基因座,1个性别识别基因座(Amel)和一个Y染色体插入缺失基因座(Indel),NH-18A通过STR复合扩增可得到含有尿嘧啶碱基的DNA片段,该类型的DNA片段在50℃时可被尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)高效水解,每次新一轮PCR扩增前增加一步50℃保温孵育可以彻底消除既往扩增产物对结果的污染威胁。经实验验证,NH-18A具有优异的抗扩增产物污染能力,且替换碱基扩增不改变DNA分型结果,检测灵敏度和DNA产物片段稳定性不降低,后续电泳分析不受影响。利用此试剂盒可以有效消除扩增产物对鉴定结果的污染。

细菌16SrDNA基因T碱基特异的PCR产物片段化

目的 探讨细菌 16SrDNA检测芯片杂交前的样本处理优化方法。方法 设计针对细菌 16SrDNA基因全长的通用引物 ,通过PCR时掺入一定比例的dUTP替代dTTP ,扩增长度为 1 5kb的片段 ,用尿嘧啶 DNA糖基化酶 (UDG)消化处理掺入到双链上的dUTP后 ,再经浓氨水特异性断开DNA双链上原dUTP处的磷酸二酯键 ,然后用聚丙烯酰胺凝受胶电泳 (PAGE)和琼脂糖电泳确认片段化的效果。结果 本实验选用的基因当dUTP与dTTP的比例在 3∶7～ 1∶1时 ,都能够获得比较理想的片段化结果。结论 通过控制一定的dUTP掺入比例再经UDG及氨水处理能够得到稳定的片段化结果。

含有尿嘧啶DNA糖苷酶基因表达载体的构建

采用自行设计的带酶切位点的上下游引物，用PCR技术，从大肠杆菌ATCC23743的DNA中，获得了含有编码尿嘧啶DNA糖苷酶（UNG）基因的PCR产物，以该PCR产物构建了重组克隆质粒PGEM／UNG，DNA序列分析结果确证其中含有完整的UNG基因．利用该重组质粒，进一步构建了重组表达质料pBV／UNG．

细菌双杂交验证古菌UDG与TRX相互作用的研究

目的验证别府硫化叶菌(Sulfolobus tokodaii,S.tokodai)i DNA碱基切除修复中重要的酶-尿嘧啶-DNA糖基化酶(uracil-DNA glycosylase,StoUDG)与硫氧还蛋白(thioredoxin,StoTRX)之间的相互作用,方法将StoUDG和StoTRX的基因分别克隆到细菌双杂交载体上,共转化至报告菌株,从筛选平板上检测StoUDG和StoTRX相互作用的强弱.结果 (1)pBT-TRX与pTRG-UDG等细菌双杂交质粒共转化至报告菌株,可使报告菌株在含氯霉素、四环素和卡那霉素的LB平板上生长;(2)含pBT-TRX与pTRG-UDG质粒的细菌双杂交报告菌株可在筛选平板上缓慢生长,且不发生自激活.结论 StoUDG与StoTRX存在较弱的相互作用,提示StoTRX参与依赖于StoUDG的DNA碱基切除修复过程,

过表达尿嘧啶DNA糖苷酶2(UNG2)可增强HepG2细胞的抗氧化作用

目的检测尿嘧啶DNA糖苷酶2(UNG2)的糖苷酶活性,研究UNG2在肝癌细胞HepG2抗氧化损伤过程中的作用。方法构建UNG2的过表达载体,利用Western blot法检测UNG2过表达效果。在HepG2细胞过表达UNG2,免疫荧光细胞化学染色观察UNG2在细胞中的表达和定位,利用含脱氧尿苷的寡核苷酸为底物测定UNG2的DNA糖苷酶活性,利用H_2O_2毒性实验研究UNG2在HepG2肝癌细胞抗氧化存活中的作用。结果在HEK293FT细胞中成功表达了UNG2,并发现UNG2主要定位在HepG2细胞核中。酶活性实验表明UNG2可以有效地切割寡核苷酸中的脱氧尿苷位点。H_2O_2毒性实验表明过表达UNG2可以显著提高HepG2肝癌细胞在H_2O_2处理后的存活率。结论 UNG2具有特异的尿嘧啶糖苷酶活性,并且UNG2能够保护HepG2肝癌细胞抵抗氧化应激损伤。

连接酶反应介导的荧光策略用于高效检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的活性

目的:灵敏检测尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)活性有利于生物医学研究和疾病预后.这里,构建一种连接酶反应介导的荧光策略用于高效检测UDG活性.方法:在本策略中,两条短寡核苷酸链分别与发夹探针环部序列的一半杂交,形成含缺口的DNA复合物.在UDG作用下,发夹探针环部的单个U碱基被移除,产生无嘌呤/无嘧啶(AP)位点.AP位点能抑制缺口处的连接酶反应,使位于发夹探针末端的立足点和链迁移区域仍彼此邻近,从而引发杂交链式反应(HCR),产生大量G四倍体(G4)结构.最后,G4与N甲基卟啉IX(NMM)结合,产生增强的荧光信号.结果:本策略检测限低至0.000 20U/mL,并能区分UDG与其它DNA糖基化酶.结论:本策略为生物医学研究和疾病预后提供了一种有潜力的工具用于灵敏定量检测UDG活性.

含尿嘧啶DNA糖基化酶的聚合酶链反应检测血清HBV DNA

为探讨含ｄＵＴＰ／尿嘧啶ＤＮＡ糖基化酶（ｄＵＴＰ／ＵＤＧ）ＰＣＲ试剂（抗污染ＰＣＲ试剂，ＰＣＲ－ｄＵＴＰ／ＵＤＧ）抗ＰＣＲ产物污染的能力及其在临床检测中的应用，采用该试剂检测２０４份病毒性肝炎患者血清中ＨＢＶＤＮＡ，并与普通ＰＣＲ试剂比较。结果显示：抗污染ＰＣＲ试剂有较强的抗污染能力，至少可阻止１００ｎｇ的ＰＣＲ产物的污染。该试剂与地戈辛素探针分子杂交所测结果的符合率（８９．３２％）高于普通ＰＣＲ与分子杂交所测的符合率（８１．４５％）。表明抗污染ＰＣＲ试剂的应用有利于防止ＰＣＲ产物的污染，提高ＰＣＲ的准确性和特异性。

中国人群耐药Ph阳性急性淋巴细胞白血病高比例ABL激酶区G∶C→A∶T突变和尿嘧啶-N-糖基化酶异常表达研究

大多数费城染色体阳性急性淋巴细胞白血病(Ph+ALL)患者在使用酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗后常表现为复发时间短及易出现ABL激酶区突变现象。为进一步研究Ph+ALL患者使用TKI治疗后易复发特点,本研究采用直接测序法检测了35例TKI耐药Ph+ALL患者ABL激酶区突变。结果发现,77.1%(27/35)患者存在ABL激酶区突变,其中T315I突变患者占ABL激酶区突变患者55.6%,特别是首次发现G:C→A:T突变Ph+ALL患者占总ABL激酶区突变Ph+ALL患者77.8%(21/27),包括T315I、E255K和E459K。其次,8例具有两种或两种以上ABL激酶区突变Ph+ALL患者染色体均为复杂核型,5例染色体由初诊单纯t(9;22)进展为复杂核型的TKI耐药Ph+ALL均出现ABL激酶区突变;并且,尿嘧啶-N-糖基化酶2(UNG2)在耐药Ph+ALL组中转录水平表达显著低于初诊组,具有统计学差异(P<0.05),而细胞核内UNG2缺失能增加G:C→A:T突变几率。结论:中国人群TKI耐药Ph+ALL具有高比例ABL激酶区G:C→A:T突变和高度基因组不稳定性。耐药Ph+ALL患者低表达UNG2可能是耐药Ph+ALL患者发生高比例ABL激酶区G:C→A:T突变的因素之一。

采用十二烷基硫酸钠抑制PCR产物中残留尿苷酶

目的 :研究抑制PCR产物中残留尿苷酶 (uracilDNAglycosylase ,UDG)活性的试剂。 方法 :采用DNA EIA技术检测在全dU DNA扩增物中含有稳定剂和不含稳定剂的样品 ,置室温 2 4h和 37℃ 4 8h的DNA杂交百分率。结果 :(1)在PCR产物中加入稳定剂A液和B液置室温 2 4h ,取 5 μl直接杂交 ,其杂交百分率为 6 1.4 70 %和6 8.996 % ,对照组为 99.2 83%。 (2 )在 30 μlPCR产物中加入稳定剂后 ,并加 1×PCR缓冲液稀释至 70 μl,置 37℃4 8h取 10 μl样品杂交 ,5 μl和 2 .5 μlA液组杂交百分率为 71.0 92 %和 6 7.6 91% ,对照组为 6 8.0 2 0 %和 6 3.90 6 %。5 μl和 2 .5 μlB液组杂交百分率为 91.333%和 80 .30 7% ,对照组为 6 3.90 6 %和 6 8.0 2 0 %。 结论 :B液可抑制PCR产物残留UDG活性 ,对保护全dU

HIV-1感染对T和B细胞核内UNG2 mRNA表达的影响

目的:探讨HIV-1感染是否影响细胞中UNG2的表达。方法:采用四步法SYBR greenⅠ实时定量RT-PCR,对HIV-1感染者的T和B淋巴细胞,以及HIV-1感染的C8166细胞核内UNG2 mRNA的表达进行测定。结果:UNG2 mRNA的表达在HIV-1感染者的T细胞和HIV-1感染的C8166细胞中被明显上调,分别是对照的8.76倍和8.14倍,而在HIV-1感染者的B细胞中却没有被上调。结论:HIV-1感染导致的UNG2表达上调,可能通过减少TCR的多样性削弱Th的功能,另一方面可能有利于病毒对UNG2的包装。

不依赖连接反应的高通量克隆方法

基因表达及功能分析需要高通量的表达系统,因而简单、经济且高效地将PCR产物或其他来源的目的基因片段构建到质粒载体中就成为了亟需解决的问题。传统克隆方法使用限制性内切酶和连接酶,其缺点是受到基因序列中原有的酶切位点的限制以及依赖连接酶导致的较低的连接转化率。为了克服这些缺点,一些不需要限制酶和连接酶的克隆方法被开发出来并运用到基因克隆中,获得了更佳的实验结果。该文就LIC、UDG克隆和Gateway重组克隆这三种不依赖连接反应的高通量克隆方法的原理及特性进行介绍。

类鼻疽伯克霍尔德氏菌UDPE检测方法的建立和应用

目的 建立防止产物污染的UDPE(UDG -DuplexPCR -EIA)技术 ,用于检测类鼻疽伯克霍尔德氏菌。方法 选择类鼻疽伯克霍尔德氏菌FUR(FerricUptakeRegulator)基因为靶序列 ,设计两对引物进行PCR扩增 ,用UDG(尿嘧啶糖基化酶 )防止PCR产物污染 ,并用微孔板杂交 -酶联显色检测扩增的PCR产物片段 ;用不同的模板考察方法的特异性和灵敏度。结果 该检测系统可以特异性地检测类鼻疽伯克霍尔德氏菌 ;对于纯DNA模板 ,检测灵敏度可以达到 10fg/ μl;对于系列稀释菌液提取的模板 ,灵敏度可达 0 1个菌 / μl;对于模拟污水标本、模拟组织标本和模拟土壤标本的检测灵敏度分别为 10个菌 / μl,10 0个菌 / μl和 10 0个菌 / μl;检测系统可以防止 10 9个PCR产物分子的污染 ;检测系统可以在 37℃下稳定保存 7d。结论 本研究建立了稳定的 ,防止产物污染 。

孕妇生殖道B群链球菌快速检测方法的建立和初步应用

目的建立一种快速、灵敏、特异的PCR检测孕妇生殖道GBS感染的方法。方法根据GBS保守序列:cfb设计特异性扩增引物,优化PCR反应,通过电泳判断结果,同时使用UNG酶,dUTP避免PCR产物污染。结果本研究通过PCR条件的反复摸索,优化了PCR检测方法。同微生物培养方法相比,PCR方法灵敏度更高,检测更快速。直接煮沸法和试剂盒法的DNA提取效率具有差别,试剂盒法更适合临床诊断使用。结论本研究成功建立了快速、灵敏、特异的孕妇生殖道GBSPCR检测方法。

防气溶胶污染的UDG-LAMP-LFD核酸检测体系的建立

目的 建立一种基于热敏UDG酶防污染的、环介导等温扩增(LAMP)技术及横向流动试纸条(LFD)联合使用的核酸检测方法,实现对HPV18的快速、可视化检测。方法 使用LAMP在线引物设计软件设计HPV18特异性引物,同时引入热敏UDG酶,建立UDG-LAMP检测体系,优化T/U碱基比例,设置对照试验验证热敏UDG酶防污染能力;根据LFD要求,设计特异性同化探针及淬灭探针,建立UDG-LAMP-LFD核酸检测体系并对LAMP反应时间进行优化;对该体系进行灵敏度、特异性及临床样品的验证,并与QPCR结果进行比较。结果 优化的LAMP反应时间为40 min, T/U比例为1∶1;热敏UDG酶孵育时间为10 min,防污染效果显著;LFD结果判读耗时5 min,整个检测时间为55 min。该UDG-LAMP-LFD核酸检测体系在以HPV18作为检测对象时,灵敏度10^(3)拷贝/μl;29例临床样品的验证结果与QPCR检测结果完全一致。结论 建立的UDG-LAMP-LFD检测体系可快速、特异、灵敏、可视化的检测HPV18,同时可避免气溶胶污染导致的假阳性。该方法对实验设备及工作人员要求较低,适合在偏远地区及基层医院使用。

残留尿苷酶对HCV cDNA破坏作用的研究

为了解残留尿苷酶对dUTP掺入cDNAPCR产物的破坏作用。采用PAGE和DNA -EIA杂交技术检测抗污染效果和DNA杂交百分率。结果表明⑴每反应 0 2单位尿苷酶 37℃ 2 0min可获得良好的抗污染效果。⑵ 94℃ 10min可灭活尿苷酶的活性。对照组PCR产物室温放置 65h杂交效率为 94 18%。试验组 - 2 0℃保存 65h杂交效率为 87 69%、77 2 4 %、76 83% ,室温 65h杂交效率为 74 77%、72 50 %、70 2 9% ,对照组与试验组间比较差异有显著性 (P <0 0 5)。试验组间比较差异无显著性 (P >0 0 5)。以上结果证实对照组室温放置 65h杂交效率下降 5 82 % ,试验组 - 2 0℃保存下降 19 4 1% ,放置 65h下降 2 7 4 8% ,可能与残留尿苷酶有关。

嗜酸嗜热古菌Sulfolobus acidocaldarius编码尿嘧啶DNA糖苷酶表达,纯化与酶学特征

【目的】嗜高温微生物面临d C脱氨基生成d U损伤的巨大压力,鉴定嗜酸嗜热古菌S.acidocaldarius来源的尿嘧啶DNA糖苷酶(UDG)切除d U损伤的酶学活性。【方法】重组表达来源于S.acidocaldarius的IV和V型UDG,经亲和纯化得到电泳纯重组蛋白。然后利用人工合成的d U(deoxyuracil)修饰寡核苷酸片段作为底物,体外鉴定两种重组UDG的酶学特性。【结果】来源于S.acidocaldarius的IV和V型重组UDG具有相似的酶学特性。IV型UDG催化效率更高,比活性是V型重组UDG的750倍左右。作为来自嗜热微生物的蛋白,S.acidocaldarius的IV和V型UDG的最适反应温度为65-75℃。【结论】IV型UDG比V型UDG水解d U碱基和脱氧核糖之间糖苷键的能力更强。

疱疹病毒尿嘧啶DNA糖基化酶基因及其编码蛋白的研究进展

概述了疱疹病毒尿嘧啶DNA糖基化酶基因的特点、编码蛋白的基本功能和分布定位及与其他蛋白的相互作用的研究进展并进行了展望,以期为该基因的深入研究提供参考。认为,疱疹病毒尿嘧啶DNA糖基化酶基因属于早期基因,其编码的蛋白通过与其他蛋白相互作用共同完成DNA的修复与合成。

一种来源于大菱鲆的热敏型尿嘧啶DNA糖苷酶的克隆表达及酶学性质鉴定

目的尿嘧啶DNA糖苷酶UDGase是一种广泛应用于qPCR、二代测序等领域的工具酶,由于其应用特性,只有热敏性UDGase才具有较大开发利用潜力。目前全球热敏性UDGase工具酶仅有2个物种来源,均有专利保护且价格昂贵,亟待开发新来源且具有优良热敏特性的UDGase。方法根据前人研究及序列分析推测大菱鲆(Scophthalmus maximus)具有热敏性UDGase。经验证,大菱鲆肝脏匀浆呈现UDGase活性。从大菱鲆肝脏匀浆克隆得到大菱鲆UDGase基因SmUDGase,并使用大肠杆菌工程菌株实现重组表达,分离纯化后进行活力表征检测。结果序列比对结果表明,SmUDGase基因克隆成功。重组表达并经亲和层析、离子交换层析分离纯化,获得纯酶纯度约95%,产率1.51mg/L,比活力2295.08U/mg。SmUDGase具有热敏性,在40℃时酶活即开始迅速降低。其他酶学性质,如pH适应范围、金属离子依赖性和对抑制剂的敏感性均与当前商业化UDGase一致。结论成功克隆并鉴定来自大菱鲆的新来源SmUDGase,该酶具有热敏感性,酶学特性接近目前商业化UDGase。并探索该酶的重组表达和纯化工艺,所得纯酶基本达到商业化生产水平,为该类型生物工具酶的开发提供了理论参考和技术储备。