免疫组化法检测解脲脲原体的研究

目的 建立检测解脲脲原体 (UU)的实验方法。方法 应用亲和素 生物素 酶复合物技术 (ABC法 )观察UU感染者 ,并与培养法和PCR法相比较。结果 ABC法对 75例临床标本的检出率为 5 2 % ,与培养法和PCR法比较 ,在统计学上差异无显著性 (P >0 .0 5 )。结论 ABC法可作为诊断UU感染的快速检测方法 ,在临床应用中有一定实用价值。

解脲脲原体MB蛋白在大肠埃希菌中的表达与纯化

目的在大肠埃希菌中克隆、表达解脲脲原体种特异性抗原（MB）蛋白并纯化出重组蛋白.方法利用Gateway系统将MBA蛋白5’端保守性序列克隆到表达载体pDEST17上，并通过载体自身所带6XHis标签，利用Ni—NTA纯化出相应的重组蛋白.结果MB蛋白5’端414bp的保守序列成功地克隆到pDET17载体上并且表达出相应大小的目的蛋白.通过Ni—NAT纯化出重组表达的MB蛋白，其纯度达到93%，浓度为0．6mg/ml.结论解脲脲原体的MB蛋白的体外表达，为下一步制备相应抗体从而建立解脲脲原体的血清学检测方法打下基础.

半固体一步培养法检测解脲脲原体临床应用比较研究

目的:探讨半固体一步培养法在临床标本上分离解脲脲原体(Uu)的应用并评价其效果。方法:采用半固体一步培养法对Uu标准菌株及泌尿生殖道分泌物标本分离培养,结果与常规两步法及(聚合酶链反应)PCR法比较。结果:稀释到1×10-4倍数Uu标准菌液在半固体培养基和常规两步法培基上均能生长并使培养基变红,PCR扩增得到274bp阳性条带。107份标本经去污染筛选的83份标本,3种方法检测Uu皆阳性18份,皆阴性48份。半固体一步培养法检测Uu阳检率(37.4%)显著高于两步法(24.1%,P<0.01),与PCR法的阳性检出率(39.8%)无显著性差异(P>0.05)。结论:半固体一步法培养Uu具有良好的敏感性和特异性,简便快速。

泌尿系支原体感染的耐药性分析

目的了解我院2004～2005年373例泌尿系感染患者的解脲脲原体（Uu）和人型支原体（Mh）感染情况,及对抗生素耐药性进行分析,指导临床合理用药。方法采用法国梅里埃生物技术公司的My-coplasma IST支原体培养鉴定及药敏试剂盒对患者分泌物进行鉴定及药敏检测,并做耐药性分析。结果373例患者中支原体感染以解脲脲原体为主,对环丙沙星耐药性为最强,其次是氧氟沙星,原始霉素耐药性最弱。结论提示临床用药应根据支原体的种类和药物敏感性选择。

解脲脲原体在三种培养基中生长情况的对比观察

目的:探讨解脲脲原体的最适培养基。方法:使用牛心浸液、牛肉汤和PPLO三种培养基,对解脲脲原体标准菌株及128份男性不育患者精液标本进行解脲脲原体的培养及生长情况的观察。结果:解脲脲原体在三种培养基均能生长,128份标本中阳性率分别为牛心浸液培养基57.0％、PPLO55.6％及牛肉汤45.2％;牛心浸液与PPLO培养解脲脲原体无显著性差异,与牛肉汤培养基有显著性差异。结论:牛心浸液培养基是一种较适合解脲脲原体生长且具有较高敏感性的培养基。

解脲支原体血清3型MB抗原N端的表达纯化及免疫学检测

目的 对解脲支原体（ＵＵ）血清３型ＭＢ抗原Ｎ端作蛋白的表达、纯化。方法 采用pGEX2T载体构建的重组质粒，用化学诱导剂 IPTG诱导表达，应用 Western斑点印迹法检测纯化融合蛋白的免疫学活性。结果 得到的ＵＵ ３型 ＭＢ抗原基因 ５'端重组克隆菌株，成功地诱导表达并纯化了 Ｎ端 ４３ＫＤ的融合蛋白，通过斑点印迹法证实该蛋白具有很好的免疫活性。结论 本实验成功地对解脲支原体血清３型ＭＢ抗原Ｎ端作了蛋白的表达与纯化，并证明具有很好的免疫活性。

慢性前列腺炎患者沙眼衣原体和解脲支原体感染的实验室诊断

对１０３８例慢性前列腺炎患者应用单克隆抗体免疫荧光法和分离培养法检测其前列腺液中沙眼衣原体（ＣＴ）和解脲支原体（ＵＵ）。结果表明：患者前列腺液ＣＴ检测阳性率为２８．４％，ＵＵ阳性率为３３％，均为非细菌性前列腺炎。对照组前列腺液中ＣＴ和ＵＵ检测均为阴性。结果提示。

解脲支原体1型MB抗原保守区基因片段的克隆、表达及纯化

目的 以解脲支原体1型培养液为模板，PER获得其MB抗原保守区部分基因，进行体外表达和纯化。方法用ExPasy网上软件Protscale分析Uu14个血清型的MB蛋白结构特点及抗原特性，选定14个血清型均在该蛋白同一保守区域有较好的抗原性，针对该序列设计特异性引物，并以UU血清1型DNA为模板进行PER，获得其MB抗原基因相应的片断，克隆入表达载体经测序鉴定后。在大肠杆菌中表达并纯化，以Western—blot鉴定表达产物。结果 准确扩增了解脲支原体1型MB抗原保守区基因片段，并在大肠杆菌中获得表达。结论 成功构建了pQE30／MB抗原部分保守序列的原核表达载体，在体外成功表达并纯化。表达和纯化的产物具有免疫反应性。

泌尿生殖系病人解脲支原体和人型支原体的培养

用添加狗血清的培养基对２８例非淋菌性尿道炎（ＮＧＵ）、１３例生殖系统炎症、４２例男性不育女性不孕症以及４例习惯性流产患者的沁尿生殖道分泌物作解脲支原体（Ｕｕ）和人型支原体（Ｍｈ）分离培养，结果Ｕｕ阳性率分别为３９３％、５３８％、６９０％和７５０％，Ｍｈ阳性率分别为２１４％、３０８％、４６６％（１０／２１）和２５０％，总的Ｕｕ和Ｍｈ阳性率分别为４６４％、６９２％、８１０％（１７／２１）和７５０％。此结果支持ＮＧＵ、生殖系统炎症、不育症、不孕症和习惯性流产等疾病部分与Ｕｕ和Ｍｈ感染有关的观点，提示在本地人群中存在着值得注意的Ｕｕ和Ｍｈ感染问题。同时认为狗血清适用于Ｕｕ和Ｍｈ的分离培养。

从生殖泌尿道感染患者的标本中分离尿素支原体的研究

用胰酶消化的中心浸液作基础培基,添加新生小牛血清、自制新鲜酵母浸液。从NGU患者的中段尿、慢性前列腺炎患者的前列腺液和男性不育患者的精液中分离尿素支原体共447份。其中NGU119例,68例为阳性(34.176％);慢性前列腺炎159例,33例为阳性(20.7％);男性不育患者89例,54例为阳性(60.6％)。用扫描电镜观察菌体呈卵圆形或球形,直径0.3～0.5μm,不呈长丝状或链状。在液体培基中,能分解尿素,产生NH_3,培基由黄色变为粉红色。在固体培基中,低倍观察菌落呈“油煎蛋”状。适宜的PH为6.0～6.5。适宜的气体为10％CO_2和90％N_2,我们认为尿素支原体的鉴定应分为两步;首先在液体培基中观察颜色变化;然后在固体培基上观察典型菌落形态。

固体培养基分离解脲支原体和人型支原体探讨

目的:研究固体培养基用于临床检测解脲(Uu)和人型支原体(Mh)及其培养的方法,方法:在原有A7固体培养基配方基础上增加营养物质和抑菌剂,制备新的固体培养基。对46例泌尿生殖道棉拭子直接用固体培养分离Uu和Mh,同时接种液体培养基作为对照。观察并记录16h、24h、40h、48h以后固体培养基长出支原体菌落的阳性例数和液体培养阳性例数,以及两种方法的杂菌污染例数,并用统计学方法分析两种方法的差异。结果:固体培养基直接分离培养结果与液体培养在不同时间段所得到的结果,阳性率无统计学差异,94.4%的菌落于24h～40h之间可辨认。直接划液体培养基的杂菌污染率分别为10.87%、28.2%和10.87%。前两者统计学有差异。结论:改进的固体培养基直接分离Uu和Mh具有鉴别准确,选择性强和菌落出现早且特征明显的优点,与液体培养相比更适用于支原体的临床检测。

解脲脲支原体的N端保守部分MB优化基因在大肠埃希菌中的高效表达

目的制备N-端保守部分多条带抗原(MB),克隆并在大肠埃希菌中表达其基因,并鉴定重组MB的抗原性。方法分析14个不同血清型解脲脲支原体(Uu)的基因排列,根据大肠埃希菌偏爱密码子,优化、设计合成DNA序列编码的氨基酸保守序列,合成的基因克隆到表达质粒,重组蛋白诱导和亲和层析纯化。结果通过对Uu 14个血清型MB抗原氮端的氨基酸序列的分析、比对,根据大肠埃希菌的偏好密码子优化、设计并合成碱基序列,目的基因片段与pET-41a构建重组质粒并转化大肠埃希菌后,IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析,得到了分子量约为45kd的重组蛋白,纯化后的MB抗原蛋白能够较特异地与特异性抗体结合,敏感性为85.7%,特异性为87.8%。结论 Uu N-端保守部分的MB蛋白已成功表达、纯化并被证明具有良好的免疫原性。

2556例门诊患者支原体、衣原体检测及支原体感染药敏分析

目的调查门诊患者的溶脲脲原体(Uu)、人型支原体(Mh)和沙眼衣原体(Ct)的感染率,分析支原体对10种常用药物的敏感情况。方法采用珠海银科和英国立明试剂进行检测,分析病原体的感染及支原体药敏。结果2006年1月-2009年10月间岳阳市第二人民医院2556例门诊标本中总阳性率为55.8%,男性和女性感染阳性率为分别40.7%、75.3%;总感染阳性率Uu为41.7%,Mh为23.1%,Ct为14.8%;单纯感染阳性率Uu为22.3%,Mh为5.6%,Ct为4.9%。年龄分段以20～30岁标本数762例、感染率64.3%为首。年度感染阳性率基本一致。以强力霉素、交沙霉素、美满霉素为药物敏感率前三位,分别为81.3%、73.4%、71.1%;氧氟沙星、环丙沙星、阿齐霉素的耐药率为前三位,分别为57.6%、55.7%、51.7%。结论本地区支原体、衣原体感染率较高,女性感染率明显高于男性。治疗用药首选强力霉素、交沙霉素、美满霉素。加强对NGU易感人群的性健康知识和婚姻道德观念教育。

固体培养基分离解脲支原体和人型支原体探讨

目的研究固体培养基用于临床检测解脲(Uu)和人型支原体(Mh)及其培养的方法。方法在原有A7固体培养基配方基础上增加营养物质和抑菌剂,制备新的固体培养基。对46例泌尿生殖道棉拭子直接用固体培养分离Uu和Mh,同时接种液体培养基作为对照。观察并记录16、24、40、48h以后固体培养基长出支原体菌落的阳性例数和液体培养阳性例数,以及两种方法的杂菌污染例数,并用统计学方法分析两种方法的差异。结果固体培养基直接分离培养结果与液体培养在不同时间段所得到的结果,阳性率无统计学差异,94.4%的菌落于24~40 h之间可辨认。直接划板法、Mh液体培养基和Uu液体培养基的杂菌污染率分别为10.87%、28.2%和10.87%。前两者统计学有差异。结论改进的固体培养基直接分离Uu和Mh具有鉴别准确,选择性强和菌落出现早且特征明显的优点,与液体培养相比更适用于支原体的临床检测。