小豆Dirigent基因家族鉴定及锈菌侵染对不同成员表达的影响

为明确Dirigent (DIR)基因在小豆抗锈病中的作用,采用生物信息学方法,对小豆DIR基因家族(VaDIRs)进行了全基因组鉴定,结果发现小豆中共有33个DIR基因,其中29个成员分别定位在8条染色体上,系统进化分析表明,VaDIRs包括DIR-a、DIR-b/d、DIR-e和DIR-f四个亚家族,对VaDIRs成员启动子区顺式作用元件的分析发现,VaDIRs启动子区均包含激素、病原体应答等元件。对小豆抗锈病品种接种后不同时间的转录组数据分析发现,差异表达基因中共有17个VaDIRs成员,其中6个于接种后24 h显著上调,2个于接种后24 h和48 h均高量表达。进一步应用qRT-PCR技术对上述8个基因在抗、感品种中应答锈菌侵染的表达分析表明,高抗品种中VaDIR14、VaDIR16和VaDIR33的表达量在锈菌侵染不同阶段均显著高于感病品种。上述结果表明,VaDIRs家族成员可作为正调节因子参与小豆对锈病的抗性。

小豆VaWRKY33基因克隆及其响应锈菌侵染的表达分析

为明确小豆VaWRKY33基因对抗锈病的作用,本研究以小豆基因组DNA为模板克隆了该基因全长。VaWRKY33的基因序列全长2 442 bp,包含4个内含子,编码区全长1 620 bp,编码539个氨基酸。VaWRKY33蛋白质相对分子质量为60.16 kD,理论等电点为7.66,属于亲水性不稳定蛋白,有一个跨膜结构域,包含蛋白磷酸化位点85个。蛋白序列分析表明,VaWRKY33包含两个保守的WRKY结构域,锌指结构类型为C2H2型,属WRKY转录因子家族GroupⅠ亚家族。VaWRKY33启动子区分析发现,除核心作用元件外,主要包括光响应、逆境及组织特异性等三类顺式作用元件。基因表达分析表明,VaWRKY33在抗病品种‘庆红1号’(QH1)上于接种病菌12 h时开始显著上调,并在整个侵染过程中始终显著高于不接种对照;在感病品种‘宝清红’(BQH)上于接种病菌48~192 h时,VaWRKY33基因显著上调表达,但其响应时间较抗病品种明显滞后,推测VaWRKY33在病菌侵染早期的迅速响应在小豆抗锈菌侵入阶段发挥正调控作用。