广州管圆线虫V期幼虫cDNA表达文库中优势诊断抗原的筛选、鉴定和克隆

目的筛选与广州管圆线虫感染小鼠血清具有较强免疫反应性的优势诊断抗原。方法用感染广州管圆线虫21d的小鼠感染血清做免疫探针筛选广州管圆线虫V期幼虫cDNA表达文库,对筛选得到的阳性克隆进行插入片段的测序和生物信息学分析,再根据测序结果设计引物扩增该基因并将其克隆入PET-30a(+)载体中。结果共获得6个阳性克隆,经DNA测序及同源性分析表明,发现其中2个与广州管圆线虫髓鞘转录因子1(MYT1)高度同源,1个与广州管圆线虫胶原蛋白家族基因(alpha-collagen)高度同源,且均为全长cDNA。克隆出广州管圆线虫MYT1全长cDNA序列,构建的新基因重组质粒经双酶切后证明含有与目的片段长度相符合的目的片段。结论用感染小鼠血清作为探针初步筛选到2个广州管圆线虫基因,并成功构建MYT1的原核表达重组质粒PET30a(+)-MYT1。

广州管圆线虫Ⅴ期幼虫cDNA文库的构建及免疫学筛选

目的构建广州管圆线虫Ⅴ期幼虫cDNA文库,免疫学筛选抗原基因。方法提取广州管圆线虫Ⅴ期幼虫总RNA,用Clontech公司的SMARTTMcDNA文库构建试剂盒构建未扩增文库,检测未扩增文库滴度和重组率后,进行文库扩增。用大鼠感染血清作免疫探针筛选文库,PCR扩增外源基因插入片段并测序,用生物信息学软件进行同源性比对,推导氨基酸序列,预测其理化性质。结果成功构建了广州管圆线虫Ⅴ期幼虫cDNA文库,免疫学筛选获得11个阳性克隆,对测序的9个阳性克隆进行初步分析,1个与广州管圆线虫Ⅴ期幼虫的1个EST同源性为99%,6个(有2个为同一克隆)与秀丽隐杆线虫和新杆状线虫均有不同程度的同源性,最高达91%。共有7个阳性克隆存在完整的开放阅读框。结论从广州管圆线虫Ⅴ期幼虫cDNA文库中初步筛选出7个有诊断意义的抗原基因,为其相关研究奠定了基础。