非洲猪瘟病毒CD2v蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

本研究以原核系统表达的非洲猪瘟病毒CD2v膜内区重组蛋白为免疫原接种BALB/c小鼠,经过细胞融合、间接ELISA筛选和多次亚克隆获得了8株能够稳定分泌CD2v蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系,分别命名为RH1、RH3、RH4、RH5、RH6、RH8、RH9和RH10。8株单克隆抗体的轻链类型均为Kappa型,其中RH1、RH5、RH9这3株单克隆抗体的重链亚型为IgG2b,其余5株单克隆抗体的重链亚型为IgG1。Western blot和免疫荧光试验证明获得的单克隆抗体具有良好的反应性,能特异地识别昆虫杆状病毒表达系统重组表达的CD2v蛋白,可为非洲猪瘟病毒结构蛋白的功能解析以及血清学诊断方法的开发提供重要的生物学材料。

非洲猪瘟病毒CD2v蛋白胞内域与胞外域的原核表达及其抗原性分析

【目的】应用大肠杆菌表达系统表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)CD2v蛋白胞外域(N-端,CD2v-N)与胞内域(C-端,CD2v-C)并分析两者的抗原性,为ASFV检测方法的研发提供试验依据和指导。【方法】构建CD2v-N和CD2v-C的重组原核表达质粒,在体外表达并纯化CD2v-N和CD2v-C蛋白,通过Western blotting对表达蛋白进行鉴定;用表达的CD2v-N和CD2v-C蛋白分别肌内接种免疫新西兰大白兔,共免疫3次,每次间隔2周;每次免疫后14 d,应用ELISA方法测定CD2v-N或CD2v-C的特异性抗体水平;用纯化后的CD2V-N和CD2v-C蛋白作为包被抗原,通过ELISA方法检测95份ASFV感染猪的血清CD2v-N或CD2v-C特异性抗体,比较CD2v-N和CD2v-C在猪体内诱导的免疫反应水平。【结果】重组蛋白CD2v-N和CD2v-C分别以包涵体和可溶性形式表达,分子质量分别为22.9和34.0 ku,均能与猪抗ASFV血清特异性结合;用CD2v-N蛋白首免家兔后14 d,血清中未检测到特异性抗体,而在CD2v-C首免的家兔血清中检测到了高滴度的特异性抗体;三免后14 d,CD2v-N和CD2v-C蛋白免疫家兔的血清特异性抗体效价分别为1∶125000和1∶107;ELISA检测结果显示,ASFV感染猪的血清中CD2v-C特异性抗体水平显著高于CD2v-N(P<0.05)。【结论】本研究表达了ASFV CD2v蛋白胞内域和胞外域,前者的抗原性比后者高,CD2v胞内域作为ASFV免疫学检测技术研究与开发的靶标更具优势。该研究结果对ASFV检测方法的研究与开发具有重要指导意义。

N-V蛋白酶体内外纤维蛋白溶解活性的实验研究

目的研究NV蛋白酶对纤溶系统的影响。方法采用纤维蛋白平板法,观察NV蛋白酶体外溶解纤维蛋白的活性。通过一次静脉给药后不同时间测定家兔纤维蛋白原(Fg)、D二聚体(DDimer)的含量及血浆优球蛋白溶解时间(ELT),观察NV蛋白酶对正常家兔纤维蛋白溶解活性的影响。通过测定家兔凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT),观察NV蛋白酶对凝血功能的作用。结果NV蛋白酶具有体外溶解纤维蛋白的活性,测定效价为30000kU·g-1。NV蛋白酶(6000U·kg-1体重,15000U·kg-1体重)可明显减少DDimer、Fg含量,缩短ELT,对PT、APTT无明显影响。结论NV蛋白酶具有纤维蛋白溶解活性,对凝血功能未见有影响。

表达非洲猪瘟病毒CD2v蛋白重组腺病毒的构建及其吸附红细胞特性的研究

为构建表达非洲猪瘟病毒(ASFV)CD2v蛋白的复制缺陷型重组腺病毒,本研究将ASFV EP402R基因融合猪泛素(Ub)基因,并经密码子优化后整合至人复制缺陷性5型腺病毒(Ad5)骨架质粒,经Pac I酶切线性化后转染293A细胞,拯救重组腺病毒(Ad5-CD2vUb-YH),结果显示,在转染8 d后出现典型细胞病变,且经测序鉴定显示插入片段与预期一致,表明拯救出一株重组腺病毒Ad5-CD2vUb-YH。利用Adeno-X快速滴度试剂盒测定F1~F3代Ad5-CD2vUb-YH的滴度,结果显示F1~F3代Ad5-CD2vUb-YH的滴度分别为1.36×10^(8)IFU/mL、1.47×10^(8)IFU/mL、2.16×10^(8)IFU/mL。利用直接免疫荧光试验(DFA)和western blot对F3代Ad5-CD2vUb-YH在Vero细胞中CD2v蛋白的表达进行鉴定,DFA鉴定结果显示感染Vero细胞的Ad5-CD2vUb-YH能与V5-FITC抗体特异性结合,细胞质内呈现特异性绿色荧光信号;Western blot鉴定结果显示感染Vero细胞的Ad5-CD2vUb-YH能与V5-HRP抗体和ASFV阳性血清均可进行特异性反应,在约102 ku和31 ku处均可见两条特异性条带,以上结果均表明CD2v蛋白得到了有效表达;进一步利用蛋白质谱对CD2v蛋白位置的胶块进行肽段序列测定并分析,结果显示其肽段序列与数据库中ASFV CD2v蛋白氨基酸序列匹配度为11%。对F3代Ad5-CD2vUb-YH感染293A细胞后吸附猪红细胞的能力进行鉴定,结果显示,Ad5-CD2vUb-YH表达的CD2v蛋白具有吸附红细胞的特性。本研究首次获得了一株重组腺病毒Ad5-CD2vUb-YH,其表达的CD2v蛋白与ASFV的CD2v蛋白特性完全一致,为ASFV CD2v蛋白吸附红细胞功能域的研究和ASFV重组腺病毒载体疫苗的研制奠定了基础。

非洲猪瘟病毒CD2v蛋白阻断ELISA候选单克隆抗体的筛选及免疫学特性鉴定

为制备非洲猪瘟病毒CD2v蛋白阻断ELISA候选单克隆抗体,并探究其免疫学特性,以真核表达的CD2v蛋白免疫BALB/c小鼠,经两次免疫后采集小鼠血清,以间接ELISA检测小鼠多抗血清效价。对血清效价最高的小鼠进行加强免疫后,取脾脏进行细胞融合。通过有限稀释法筛选能够稳定分泌CD2v单克隆抗体的杂交瘤细胞株。采用小鼠体内诱生腹水法和辛酸-硫酸铵法获得纯化的CD2v单克隆抗体,对其进行免疫学特性检测。间接ELISA试验显示,4号小鼠血清效价最高(1:72900),选取该小鼠脾脏进行细胞融合,经过筛选得到4株杂交瘤细胞,分别命名为21D10、21G8、36A3和38G8,亚型鉴定均为IgG_(1)/κ,经检测36A3 ELISA效价最高,可达1:2.187×10^(5)。免疫荧光试验显示,36A3抗体能与细胞内表达的CD2v蛋白发生特异性反应,而与携带His标签的p30蛋白无交叉反应;特异性鉴定结果显示,36A3抗体特异性良好,与猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒以及非洲猪瘟病毒p72蛋白均无反应;亲和力检测显示,36A3抗体亲和力较高,亲和常数(Ka)为9.68×10^(8)L/mol。初步建立的阻断ELISA试验显示,36A3能够有效区分阴阳性血清,N/P高达12.53,提示其为非常有效的阻断ELISA候选抗体。本试验结果为深入研究非洲猪瘟病毒CD2v蛋白功能及研发非洲猪瘟病毒阻断ELISA血清学检测试剂盒奠定了基础。

人血浆因子V蛋白免疫印迹分析及其临床应用

目的 建立人血浆因子Ｖ（ＦＶ）蛋白免疫印迹分析，对遗传性ＦＶ缺乏症家系成员血浆ＦＶ含量进行分析。方法 以３３％饱和硫酸铰从多克隆兔抗人ＦＶ抗血清中纯化ＩｇＧ，待测血浆行４％～１２％梯度的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，继之电转印至硝酸纤维膜上。结果 在３３０ ｋＤ附近，正常人混合血浆呈现一明显的条带，患者母亲对应条带的显色强度明显弱于正常对照，而患者则完全缺如，且未能检出其他较小的ＦＶ片段产物。结论 我们建立的人血浆ＦＶ蛋白免疫印迹分析法对于遗传性ＦＶ缺乏症的辅助诊断及分型具有重要作用。该家系属于Ｉ型遗传性ＦＶ缺乏。

犬瘟热病毒V蛋白的表达、鉴定及亚细胞定位

为研究犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)V蛋白的功能,将CDVV基因片段与pGEX-6P-1载体连接,构建pGEX-6P-1-CDV-V重组表达质粒,通过原核表达系统表达了V蛋白,并将纯化的V蛋白免疫BALB/c小鼠,制备阳性血清。同时,将CDVV基因片段与pcDNA3.1载体连接,构建pcDNA3.1-CDV-V重组表达质粒,经转染Vero细胞后,用激光共聚焦技术确定V蛋白在真核细胞中的分布及亚细胞定位。结果显示,成功表达了V蛋白,并制备了阳性血清。重组质粒pcDNA3.1-CDV-V在外源真核细胞Vero中获得了表达,表达蛋白主要聚集于细胞质。本试验结果为进行CDV V蛋白的功能研究奠定了基础。

新城疫病毒V蛋白研究进展

近年来,新城疫病毒(NDV)的感染及致病宿主范围呈现不断扩大的趋势。新城疫病毒V蛋白在病毒抑制干扰素信号转导、防止细胞凋亡的发生、改变宿主细胞周期、阻断双链RNA信号转导和抑制干扰素的生物合成等各种宿主逃逸机制中起着重要作用,并在病毒的致病性和宿主嗜性等方面也发挥了重要作用。基于对新城疫病毒V蛋白研究的深入,论文对新城疫病毒V蛋白的分子特性及其功能性研究做一简要概述。

野鸭源6型副黏病毒V蛋白在DF-1细胞中的定位

为了研究副黏病毒V蛋白在DF-1细胞中的表达及定位情况,试验采用2011年对吉林省某湿地野鸭进行流行病学监测时分离、鉴定出的1株6型禽副黏病毒(APMV6),分析该病毒的全基因组序列,并通过融合PCR方法扩增V基因片段,并将该片段与pCDNA3.1载体连接,获得pCDNA-6V重组表达质粒,转染DF-1细胞,经Western-blot分析和激光共聚焦显微镜观察。结果表明:pCDNA-6V融合蛋白在DF-1细胞中获得表达,且主要分布于细胞质中。说明副黏病毒V蛋白定位于宿主细胞质中。

禽6型副粘病毒V蛋白对抗宿主细胞干扰素β的产生

[目的]研究禽6型副粘病毒V蛋白对抗宿主细胞干扰素β的产生的机制。[方法]构建真核表达禽6型副粘病毒P、V、W蛋白的重组载体,分别与IFN-β-Luc、NF-κB-Luc、PRDⅢ/I-Luc、AP-1-luc报告质粒共转染HEK-293T细胞,接种仙台病毒刺激细胞后,测定细胞内萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶活性。[结果]禽6型副粘病毒V蛋白能通过降低NF-κB的活性,进而显著抑制宿主细胞产生IFN-β。[结论]该研究初步阐明了禽6型副粘病毒V蛋白对抗宿主天然免疫的机制。

基于新城疫病毒V蛋白鉴别鸡群感染与免疫的间接ELISA方法的建立

本研究以新城疫病毒(NDV)V蛋白羧基端结构域(Vc)的重组蛋白为包被抗原,建立了用于检测NDV V蛋白抗体的间接ELISA方法,并采用该方法检测了鸡群免疫或接毒后血清中的V蛋白抗体水平。结果显示:两组不同NDV灭活疫苗组在免疫后的3周内检测结果均为阴性;两组灭活疫苗免疫3周后再人工感染NDV强毒的鸡群,攻毒后第7、14和21 d,NDV阳性率分别为60%、80%、70%和50%、80%、70%;两组不同的NDV弱毒疫苗免疫组鸡群,仅在免疫后第21 d阳性率分别为20%和10%。以上结果表明,NDV疫苗免疫组与强毒感染组的V蛋白抗体阳性率存在明显差异,本方法可在群体水平上区分新城疫疫苗免疫与强毒感染鸡群,为NDV血清学诊断和流行病学调查提供了一种新的检测手段。

不同NDV株V蛋白多克隆抗体的制备和初步应用

新城疫病毒(NDV)的V蛋白是一种干扰素拮抗蛋白,该蛋白表达量的差异对NDV细胞嗜性的影响是目前的热点问题。为制备NDV V蛋白多克隆抗体,本研究以Class I NDV 9a5b株和Class II NDV ZJ1 P基因为模板扩增V蛋白PNT结构域和V蛋白半胱氨酸富集区(CTD)结构域,分别克隆至pET-28a(+)载体和pCold TF载体中,获得表达V蛋白或其CTD结构域的重组表达质粒。将重组质粒转化大肠杆菌诱导表达;纯化重组蛋白,并分别免疫小鼠,制备针对Class I和Class II NDV V蛋白的多克隆抗体。利用该多克隆抗体,western blot检测NDV 9a5b、La Sota、ZJ1、Herts/33株感染HeLa和DF1细胞后V蛋白的表达量变化。结果显示制备的多克隆抗体可以用于NDV V蛋白的检测,V蛋白在易感宿主禽源细胞中的表达量明显高于哺乳动物细胞。研究表明NDV V蛋白的表达水平与宿主细胞的种属差异相关。

副黏病毒V蛋白抗干扰素作用的研究进展

副黏病毒的V蛋白是结构蛋白P基因内使用不同的阅读框编码产生的一种非结构蛋白,具有抗干扰素(IFN)的作用。副黏病毒科不同成员间V蛋白的产生机制不同,国内外利用反向遗传、RNA干扰等技术缺失或抑制V蛋白,通过检测IFN产生及作用通路上关键蛋白的变化情况研究其抗IFN作用机制,发现副黏病毒V蛋白既可直接阻止IFN产生,也可阻断IFN抗病毒JAK/STAT作用通路。文章对副黏病毒V蛋白、干扰素的产生及其抗病毒作用机制,特别是V蛋白抗IFN作用的研究进展及应用前景做一综述。

非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的生物信息学分析及多表位疫苗的设计

本试验运用各种生物信息学技术对非洲猪瘟病毒(ASFV)Georgia 2007/1株CD2v蛋白的理化性质、信号肽、跨膜区、抗原决定簇、抗原性、二级及三级空间结构进行初步分析并预测其B、T淋巴细胞的优势表位,从而设计以pET28a为载体的重组CD2v蛋白的多表位疫苗。评估结果表明,CD2v蛋白是亲水性的分泌蛋白,含有11个抗原决定簇,其α螺旋、β转角、无规则卷曲和延伸链的比例为17.22%、5.28%、50.00%和25.70%。基于CD2v蛋白的多表位疫苗稳定性强,具有免疫原性且为非过敏原,有望成为防控非洲猪瘟的一种有效手段。

不同原核表达载体对非洲猪瘟病毒CD2v蛋白可溶性表达及免疫反应性比较

本研究旨在系统性地探究不同原核表达载体对非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的可溶性表达差别,并利用临床非洲猪瘟病毒抗体阳性血清比较包涵体和可溶性CD2v蛋白的免疫反应性。利用5种原核表达载体pCold-TF、pET28a、pMAL-C6T、pGEX-4T-1、pET32a分别表达去除信号肽和跨膜区的非洲猪瘟病毒CD2v蛋白,利用镍-氨三乙酸(nickel-nitrilotriacetic acid,Ni-NTA)亲和层析法分别纯化源自pET28a和pCold-TF表达载体的包涵体和可溶性CD2v蛋白,并用间接酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法比较纯化蛋白的免疫反应性。结果显示,pCold-TF载体以表达可溶性蛋白为主,pMAL-C6T载体同时表达包涵体和可溶性蛋白,而其他载体主要表达包涵体蛋白。临床非洲猪瘟病毒抗体阳性血清检测数据显示,可溶性蛋白的免疫反应性显著优于包涵体蛋白(P<0.05)。pCold-TF载体的触发因子(trigger factor,TF)标签可促进CD2v蛋白的可溶性表达,其表达蛋白的免疫反应性优于包涵体蛋白。本研究结果为CD2v蛋白的免疫原性研究奠定了基础,亦为其他重要抗原的可溶性表达提供了思路。

副黏病毒V蛋白阻断干扰素信号通路的分子机制研究进展

副黏病毒V蛋白是由其P基因编码的一种非结构蛋白,能够阻断IFN信号通路,拮抗IFN的抗病毒效应,通常认为是病毒毒力因子之一。在副黏病毒感染过程中,V蛋白靶向性地与IFN信号通路JAK-STAT途径中关键信号转导与转录活化因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)蛋白相互作用,从而发挥拮抗IFN下游信号的功能。不同副黏病毒V蛋白与STAT作用机制也不尽相同。本文对副黏病毒V蛋白产生,IFN信号通路及不同副黏病毒拮抗IFN信号分子机制做一概述。

新城疫病毒V蛋白C端酵母双杂交诱饵质粒的构建与鉴定

为构建新城疫病毒(NDV)V蛋白C端酵母双杂交诱饵质粒,用RNA试剂盒提取NDV F48E9株的RNA,通过反转录试剂盒将抽提的RNA反转录,以反转录合成的c DNA为模板,通过PCR扩增,获得V蛋白C端基因(VCTD)。通过酶切连接的方法将V蛋白C端基因克隆至p GBKT7载体上,命名为p GBKT7-VCTD。将p GBKT7-VCTD转化酵母Y2H Gold酵母感受态细胞,转化产物涂布营养缺陷型平板,观察平板上菌落生长情况,判定诱饵质粒有无自激活能力;同时挑取平板上的生长的菌落接种液体培养基培养,绘制生长曲线,判定p GBKT7-VCTD诱饵质粒有无毒性。酶切和测序结果表明,成功构建p GBKT7-VCTD诱饵质粒,且该诱饵质粒在酵母细胞中无毒性和自激活能力。本研究成功构建了p GBKT7-VCTD诱饵质粒,为筛选NDV V蛋白C端纳米抗体奠定基础。

非洲猪瘟病毒Georgia 2007/1株CD2v蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

本研究旨在通过原核表达系统表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)Georgia 2007/1株EP 402 R基因,获得其编码的CD2v重组蛋白,并针对纯化的CD2v重组蛋白制备多克隆抗体。将ASFV EP 402 R全长基因进行密码子优化后连入pET-28a(+)表达载体,构建原核重组表达质粒,经1 mmol/L IPTG于16℃诱导12 h后,利用SDS-PAGE和Western blotting对重组蛋白进行表达鉴定和反应原性分析。以纯化的CD2v重组蛋白为免疫原制备鼠源抗CD2v多克隆抗体,随后以间接ELISA方法、间接免疫荧光试验及Western blotting分别检测多克隆抗体的效价和特异性。结果显示,ASFV EP 402 R基因克隆至pET-28a(+)获得pET-28a-EP402R重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后经诱导表达获得CD2v重组蛋白,其大小约为47 ku,重组蛋白主要以包涵体形式存在,部分也可以融合表达蛋白形式存在。Western blotting结果显示,其可溶性上清经镍柱纯化后能被ASFV阳性血清识别,具有良好的反应原性。间接ELISA检测该多克隆抗体效价可达1∶512000,间接免疫荧光试验和Western blotting表明该多克隆抗体可特异性识别真核表达的CD2v蛋白。以上结果表明,通过原核表达的ASFV CD2v重组蛋白具有较好的免疫原性,利用重组蛋白制备的多克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性,为进一步研究ASFV EP402R生物学功能及基因缺失毒株的鉴别诊断和疫苗开发提供技术储备。

非洲猪瘟病毒CD2v蛋白单链抗体的制备及鉴定

为了获得特异性针对非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)CD2v蛋白单链抗体(scFv),本研究以CD2v阳性单克隆抗体杂交瘤细胞为模板,通过PCR扩增得到抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,利用Overlap-PCR在VH和VL基因间引入短肽(Gly4Ser)2连接形成scFv。将其插入原核表达载体p ET28a(+)中,并转化至大肠杆菌BL21(DE3),经1 mmol/L IPTG于25℃条件下诱导表达,通过ELISA对复性scFv蛋白进行反应活性评价。结果显示,通过CD2v蛋白的阻断ELISA筛选出分泌阻断效果良好的单抗杂交瘤细胞株4B8,并成功扩增获得单克隆抗体4B8的重链可变区(VH,399 bp)、轻链可变区(VL,369 bp)及由GS Linker连接而成的4B8-scFv基因(744 bp);SDS-PAGE结果显示,4B8-scFv在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式表达,通过尿素变性及透析复性,得到纯度较高的4B8-scFv(相对分子质量约为34 ku);间接ELISA结果表明,4B8-scFv与CD2v蛋白具有良好的反应活性。

野鸭源新城疫病毒V蛋白基因在DF-1细胞中的表达及V蛋白的亚细胞定位

为研究野鸭新城疫病毒V蛋白基因在真核细胞中的表达及V蛋白的亚细胞定位,将新城疫病毒V基因片段与pcDNA3.1载体连接,构建pcDNA3.1-V重组表达质粒,经脂质体转染DF-1细胞后,用Western-blot验证该基因在DF-1细胞中的表达;用激光共聚焦显微成像技术确定V蛋白在真核细胞中的分布及亚细胞定位。结果显示,重组质粒pcDNA3.1-V在外源真核细胞DF-1中获得了表达,表达蛋白主要聚集于细胞质。研究结果为进行野鸭源新城疫病毒V蛋白的功能研究奠定了基础。