应用Bac-to-Bac系统高效表达人类错配修复基因hMLH1及其错义突变体

目的利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在Sf9昆虫细胞中实现人类错配修复基因h MLH1及其错义突变体的高效表达。方法分别用Bam HI和Not I双酶切构建于pc DNA载体中的全长野生型h MLH1基因及T117M和V384D错义突变型DNA片段,回收后定向克隆至p Fast Bac1转座载体中,经酶切鉴定后转化DH10Bac感受态细胞,PCR方法筛选阳性菌落,提取重组Bacmid,反复感染Sf9昆虫细胞,用SDS-PAGE和Western blot方法鉴定目的蛋白的表达。结果提取转染72h后的Sf9细胞总蛋白,用7%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,可见分子量为85k Da清晰的蛋白条带,经Western blot方法证实该条带为h MLH1基因的表达产物。结论利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在Sf9昆虫细胞中大量表达出h MLH1野生型和T117M及V384D错义突变体蛋白,为进一步开展体外错配修复实验奠定了良好的基础。