新城疫活疫苗(V4/HB92克隆株)对鹌鹑、鸽临床试验

应用兽药GMP车间生产的3批新城疫活疫苗(V4/HB92克隆株)中试产品分别在安陆和云梦对7 500只鹌鹑和4 500只鸽进行了临床效力试验。安全试验结果表明,3批疫苗用10倍剂量分别对30日龄的鹌鹑和鸽滴鼻,观察10 d,无任何毒副反应。免疫效力试验分为滴鼻和饮水2种方法,3批疫苗滴鼻免疫3 000只鹌鹑,免疫后2周抗体开始上升,ND-HI达3.9 log2,抗体持续16周;饮水免疫的3 000只鹌鹑,2周抗体为3.1 log2,抗体持续8周。三批疫苗滴鼻免疫1 500只鸽,免疫2周ND-HI抗体达4.1log2,抗体持续8周;饮水免疫的1 500只鸽,免疫后2周抗体为3.8 log2,持续8周抗体仍然为4.1 log2。试验攻毒保护力测定结果与ND-HI抗体水平呈正相关。

鸡新城疫V_4克隆株疫苗研究与应用 Ⅰ.V_4克隆株/HB92选育及生物学特性测定

从澳大利亚引进NDV4自然无毒株,经耐热选育,利用蚀斑技术克隆病毒,选育出NDVHB92株,56℃ 6h对该毒株病毒活性没有影响;室温(10-25℃)条件下保存6个月,37℃保存2周,病毒仍有活力;37℃下保存8周,HA滴度不变。鸡胚平均致死时间(MDT)>168h;1日龄鸡脑内致病指数(ICPI)为0.00;鸡静脉致病指数(IVPI)为0.00。将含毒尿液接种18日龄雏鸡,接种量为105EID50,接种后14d测定NDHI抗体效价≥24,强毒攻击保护为100％。

新城疫病毒V4株F基因的克隆与核苷酸序列分析

本试验采用RT_PCR方法对NDVV4 克隆株V4(Hr)的F基因进行了扩增与克隆,并以Sanger’s 双脱氧末端终止法测定出其核苷酸序列,推导出氨基酸序列。F基因全长为1662bp,单一的开放阅读框编码553 个氨基酸的长肽。F蛋白的疏水构型有3 个强疏水区;F蛋白上共有12 个Cys 残基位点和5 个潜在糖基化位点。同其亲本毒株Queensland 相比,核苷酸同源率为99.3% ,氨基酸同源率98.7% 。上述主要功能区的序列完全一致,但其中7 个氨基酸的不同,的确导致了二级结构的变化(主要表现为α_螺旋、β_折叠、β_转角和β_卷曲的数量和位置的不同),而且单一的氨基酸差异足以导致二级结构的变化,如:214位的P对L的替换,就导致212 ～215

新城疫病毒HB92株M基因的克隆和序列分析

采用RT PCR方法扩增了新城疫病毒 (NDV)无毒耐热株 (HB92株 )M基因 ,将其克隆于 pGEM T载体 ,并进行了序列测定和分析 .结果显示 ,测定的M基因长 12 2 3个核苷酸 ,包含一个 10 95个核苷酸的开放阅读框(ORF) ,编码 36 4个氨基酸 .与已报道的 10株NDVM基因比较 ,核苷酸同源性为 88.4 %～ 95 .8% ,氨基酸同源性为 89.8%～ 95 .3% ,HB92株与V4株M基因核苷酸的同源性最高 (达 95 .8% ) .NDVM蛋白分子中有 9对碱性氨基酸 ,在多肽的第 117～ 12 0位有一个含 4个氨基酸CKKS的特征性结构 .这些结果为揭示NDVHB92株的分子生物学背景 ,了解NDV的分子进化和遗传变异机理 ,进而开发利用HB92株奠定了基础 。

新城疫活疫苗HB92克隆株的筛选、纯化与细胞培养特性观察

将引进的新城疫V4无毒耐热毒株连续用鸡胚传代,每次挑选48～96 h有明显病变的死亡鸡胚,取其尿囊液毒于-20℃保存,观察V4毒株对鸡胚毒力的病理变化。结果显示,经过20代次的鸡胚毒力筛选,V4毒株对鸡胚的致死率从小于10%上升至20%以上,接种后120 h的活胚有明显地萎缩症状。将鸡胚20代次以上筛选的V4病毒液在鸡胚成纤维细胞上传代培养,并进行蚀斑筛选纯化病毒,直到第5代才出现明显地细胞病变。使用二层琼脂进行病毒的蚀斑分析,第二层琼脂糖在第一层凝固后72 h覆盖,8 h后NDV鸡胚成纤维细胞适应株的蚀斑出现,蚀斑大小直径在1～2 mm变化。通过对NDV V4鸡胚毒力筛选和蚀斑纯化,获得了一株蚀斑克隆株(NDV HB92)。