内蒙古包头地区幽门螺旋杆菌VacA基因分型相关研究

目的:通过分析研究内蒙古包头地区感染幽门螺旋杆菌(H.pylori)菌株的空泡毒素基因(vacuolating cytotoxin gene,VacA)亚型,探讨H.pylori在内蒙古地区的流行病学特点。方法:收集2018年6月至2019年6月在包头医学院第二附属医院就诊的308例不同胃、十二指肠相关疾病患者的H.pylori感染阳性患者活检标本,通过DNA分析,利用聚合酶链式反应技术扩增VacA基因亚型,从而对VacA基因型进行研究。结果:通过对308例H.pylori感染患者分析发现,VacA的总阳性率为57.14%,包头市区内VacA(+)52.31%,旗县区VacA(+)55.75%,市区与旗县区之间无统计学意义。VacA亚型阳性率sla为91.32%、slb为8.65%、s2为0.56%、ml为32.67%、m2a为89.54%、m2b为28.32%。vacA组合基因型(亚型嵌合体)以sla/m2a为主,占67.05%。sla、mlb型与相关疾病分布差异无统计学意义,而vacA的m2a型与疾病分布差异有统计学意义。结论:内蒙古包头地区幽门螺旋杆菌VacA基因分型以sla及m2a为主,其中m2a与疾病来源有关,这为内蒙古地区H.pylori感染的防控提供新的理论依据。

幽门螺杆菌vacA基因多态性与慢性胃病

目前研究表明,幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)与慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌以及胃粘膜相关性淋巴样组织(MALT)淋巴瘤等疾病密切相关[1-4].尽管Hp是世界上流行较为广泛的慢性感染病原菌之一,但大多数Hp感染者无明显临床症状,只有少数出现慢性胃炎、消化性溃疡等临床表现,甚至发展为胃癌或胃MALT淋巴瘤,这可能与Hp的致病力有关[5-8].空泡毒素(VacA)是Hp产生的一种重要致病因子,能介导真核细胞空泡样变性[9-13].近年研究表明[3,14-20],Hp的vacA基因内存在不同的信号区(sh,s1b,s2)和中间区(m1,mla,m2),其多态性可能与致病力有关.我们采用PCR检测Hp的vacA基因多态性,分析vacA基因多态性特点及其与Hp相关性胃病的关系.

幽门螺杆菌vacA基因重组表达的包涵体复性及ELISA方法的建立

目的:通过对vacA重组工程菌表达产物包涵体的变性、复性,提高表达产物的生物学活性,建立ELISA方法,讨论VacA抗原规模生产的可行性.方法:利用已经构建的表达VacA抗原的工程菌,用IPTG诱导,表达的包涵体通过系列条件的变性、复性、透析,并经活性鉴定.所制抗原用以包被ELISA板,建立ELISA方法并确定抗原的生物学活性.结果:重组工程菌可表达Mr3300的目的蛋白,表达形式为包涵体,条件优化后的包涵体经SDS-PAGE显示纯度达95%以上,活性经ELISA法测定正常人126例和blot电泳测定结果符合率为97.1%.结论:包涵体变性复性后生物活性大幅度提高,并且具有良好的重复性和稳定性,可作为幽门螺杆菌疫苗制备的候选抗原及临床检测的诸多方法的抗原原料.

幽门螺杆菌vacA基因毒性相关片段的克隆及序列分析

目的 vac A 基因编码的蛋白是幽门螺杆菌的一个重要毒力因子,通过空泡化作用损伤上皮细胞.vacA 基因与 Hp 感染者的临床发病有着密切的关系,vacA 的基因型决定毒素蛋白体外表达水平的高低.我们从幽门螺杆菌88022菌株中扩增出vacA 基因毒性相关片段,进行序列测定和序列比较分析,为Hp 的临床检测奠定基础.方法以该菌株总 DNA 为模板,紧随 vacA 基因序列 s 区保守区域的引物(位于316bp～335bp 和1198bp～1218bp)扩增vacA 基因的一个903bp 片段,编码的氨基酸为34～334位,用13amHI 和 Pst Ⅰ双酶切后克隆入 pGEM-3Zf(-)质粒载体,以双脱氧法双向测定目的片段的序列,拼接出该片段的全序列,并与已知的 Hp vacA 基因序列作比较.结果所得序列与 Hp 国际标准株 CCUG17874(GeneBank gi619248)和 NCTCll638(GeneBank gi 495469)的 vacA 基因序列完全一致,氨基酸序列分析和所报道的结果一致.结论构建了 Hp vacA 基因毒性相关片段的重组克隆,为以后的进一步研究奠定了基础.

球形幽门螺杆菌vacA基因表达质粒构建及表达

目的构建球形幽门螺杆菌vacA基因的重组表达质粒,初步观察其在E.coli中的表达。方法采用亚克隆技术,用BamHⅠ和SacⅠ从重组质粒pMD-18T-vacA上切下vacA基因,插入表达载体pET32a(+)质粒,转化大肠埃希菌BL21,在氨苄青霉素阳性的LB平板上筛选阳性重组子,并经双酶切及PCR扩增鉴定。重组质粒pET32a(+)-vacA转化大肠埃希菌,(IPTG)诱导表达后进行(SDS-PAGE)电泳和凝胶扫描定量分析。结果重组质粒酶切和PCR鉴定与预期结果相符,成功构建携带vacA基因的重组原核表达质粒pET32a(+)-vacA。核酸序列测定及同源性分析证实,表达质粒pET32a(+)-cagA中所含vacA基因与GenBank中的vacA序列同源性达到99.2%。vacA基因在大肠埃希菌中诱导表达后获得约156 kD蛋白,蛋白含量占全菌体蛋白含量15.5%。结论成功构建球形H.pylori vacA基因重组表达质粒,并获得高效表达,为研究该基因蛋白的生物学特性及DNA疫苗研制奠定了基础。

浙江省幽门螺杆菌cagA、vacA基因型的流行病学研究

目的调查浙江地区幽门螺杆菌(helicobacter pylori,Hp)基因型的分布及其与临床疾病的关系。方法采用特异引物聚合酶链反应(PCR)分析262株幽门螺杆菌的vacA基因多态性分布特点,并对其进行初步统计分析。结果浙江8个地区分离培养的Hp菌株262株,VacA m1b基因型占27.10%(71/262);VacA m2基因型占64.89%(170/262);VacA m1b-m2基因型占4.20%(11/262);不同地区间VacA s区基因型和VacA m区基因型分布差异无统计学意义(P>0.05)。慢性胃炎分离株中VacA m1b基因型占26.47%(27/102);VacA m2基因型占66.67%(68/102);VacA m1bm2基因型占2.94%(3/102)。消化性溃疡分离株中VacA m1b基因型占29.41%(40/136);VacA m2基因型占61.76%(84/136);VacA m1bm2基因型占3.68%(5/136)。胃癌分离株中VacA m1b基因型占16.67%(4/24);VacA m2基因型占75.00%(18/24);VacA m1bm2基因型占4.17%(1/24)。不同临床疾病间VacA m区基因型分布差异无统计学意义(P>0.05)。结论浙江8个地区Hp菌株的优势基因型为cagA+、va-cAs1/m2,vacA的s区和m区的分布与分布个体的临床类型无关。

幽门螺杆菌vacA基因分型和cagA基因检测

〔目的〕建立检测幽门螺杆菌 (Hp)的 cag A、vac A基因及其基因型的方法 ,观察 vac A基因型与 cag A状态的相关性。〔方法〕应用聚合酶链反应 (PCR)对 172份 Hp阳性标本进行 Hp cag A和 vac A基因检测及其基因型分析。〔结果〕 172份 Hp阳性标本中 ,vac A阳性数 172 (10 0 % ) ,cag A阳性数 93(5 4.0 7% ) ;49例萎缩性胃炎患者中 ,cag A阳性菌株感染 47例 (95 .92 % ) ,6 4例浅表性胃炎患者中 ,vac A阳性菌株感染 2 8例 (4 3.75 % ) ,两者有显著差异 (p<0 .0 5 ) ;vac A中间区域型 m1和 m2分别为 80和 92例 ,两者无明显差异 (p>0 .0 5 ) ,信号序列型 sla、slb、s2分别为 82、6 8、2 2例 ,sla与slb无明显差异 (P>0 .0 5 ) ,sla、slb、sl(sla+ slb)均显著多于 s2型 (p<0 .0 5 )。检出所有的 6种信号序列 /中间区域组合型 ,slb/ m l和 sla/ m2分别为 48和 5 2例 ,明显多于其它基因型 (p<0 .0 5 ) ,s2 / ml仅为 2列 ,明显少于其它基因型 (p<0 .0 1)。对 Hp vac A基因型与 cag A状态相关性分析 ,s1/ m1、s1/ m2、s2 / m1、s2 / m2型的 cag A阳性数为分别为 45、48、0、0 ,93份 cag A阳性标本均为 s1(s1/ m1+ s1/ m2 )。〔结论〕vac A基因存在于所有 Hp中 ,而 cag A基因仅存在于 5 0 %～6 0 %的 Hp中 ,vac A

幽门螺杆菌vacA基因PCR-RFLP分型

目的为幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,简称Hp)的基因分型提供一种可选择的指标,并通过分型与空泡毒素(vacuolatingcytotoxingeneAproduct,VacA)表达情况分析HpvacA基因的多态性。方法用自行设计的引物对18株Hp的vacA基因进行扩增,用7种限制性内切酶对基因扩增产物进行限制性片段长度多态性(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,RFLP)分析;通过细胞测毒法对18株HpVacA活性进行检测。结果18株Hp的vacA扩增产物为2.75kb左右,但长度有差异;只有HeaⅢ可将vacA基因切出整齐的谱型,18株Hp被分为12种谱型。未发现VacA表达相关的谱型。结论HpvacA基因具有一定的多态性,而vacA基因的PCR产物经HeaⅢ酶切的RFLP分型可作为Hp基因分型的较理想选择指标。为Hp分子流行病学调查提供一种有效方法。

球形幽门螺杆菌vacA基因的克隆及序列测定

目的:克隆球形幽门螺杆菌(HpC)vacA基因全长片段,并进行序列分析。方法:采用亚抑菌浓度的抗生素作用,使幽门螺杆菌(Hp)标准株NCTC11637发生球形变异,收集球形Hp。从HpC基因组DNA中特异扩增出vacA基因片段,扩增的目的片段经纯化回收后克隆到pMD-18T中,转化人大肠杆菌JMl09。阳性重组质粒用PCR及双酶切鉴定,并进行序列测定。结果:从HpC基因组DNA中扩增出3 888 bp的vacA基因,构建重组质粒pMD-18T-vacA,酶切产物的大小与预期相符。测序结果显示,HpC与已公布的Hp vacA基因序列的同源性达99.8％。结论:成功地对HpC、vacA基因进行体外扩增及构建原核重组质粒pMD-18T-vacA,并经酶切及序列分析所验证,证明HpC含有完整的vacA基因,其可能与Hp的致病性有关。

幽门螺杆菌vacA基因的克隆和序列分析

空泡毒素是幽门螺杆菌产生的已知的唯一蛋白毒素,该毒素与感染者胃肠上皮损伤和溃疡形成密切相关,同时也是幽门螺杆菌免疫预防和免疫治疗的重要候选组分。从幽门螺杆菌NCTC11637染色体DNA中经PCR方法获得了2.9kb的该基因成熟肽全长序列,将该基因克隆至载体pET22b+,经PCR扩增和酶切鉴定后序列分析表明,该基因与已知序列完全一致。

中国幽门螺杆菌强细胞毒株和弱细胞毒株vacA基因全长序列特征与VacA活性的关系

目的:探讨中国幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)强细胞毒株和弱细胞毒株vacA基因序列差异对其VacA活性的影响.方法:从GenBank数据库下载4个强细胞毒株和4个弱细胞毒株vacA基因全长DNA和氨基酸序列,利用DNAMAN、lasergene 7.0、MEGA 5.03个生物信息学软件对其进行分析.结果:(1)中国H.pylori强细胞毒株、弱细胞毒株和西方强细胞毒株60190株3者之间在vacA基因序列上都存在明显的差异,这些差异主要集中在vacA基因p55结构域,表现为疏水性氨基酸与极性氨基酸之间的转换;(2)弱细胞毒株还存在多个插入变异位点;(3)强细胞毒株和弱细胞毒株,中国和西方分离株在系统发育树中分别聚类为不同的谱系.结论:vacA基因序列差异和插入突变可能是导致中国不同H.pylori VacA活性差异的重要原因.

不同胃痛证型幽门螺杆菌vacA基因亚型和胃上皮核因子-κB的表达

目的探讨幽门螺杆菌感染、vacA基因亚型和胃上皮NF-κB蛋白表达在慢性胃痛证型的分布及关系。方法收集100例慢性胃痛患者胃窦黏膜,其中脾胃湿热证57例、肝气犯胃证24例、脾胃虚寒证19例,采用免疫组化方法检测胃黏膜上皮细胞NF-κB P65蛋白,特异引物PCR分析vacA基因亚型。结果 100例标本中,Hp感染率为81%,vagA基因亚型sla阳性率90.1%,m2阳性率85.2%;Hp定植密度与NF-κB P65表达呈正相关;与阴性组比较,s1a+和m2+提高了NF-κB P65表达(P均<0.01),Hp定植密度、vacA基因亚型、NF-κB P65蛋白在3种中医证型中差异无统计学意义。结论 vacA基因以s1a/m2亚型为主,Hp感染增加了NF-κB P65蛋白的表达,但Hp定植密度、vacA基因亚型、NF-κB P65蛋白不能作为中医证型的预测指标。

具有cagA、vacA基因的幽门螺杆菌在南京地区部分胃肠疾病患者中的感染状况

利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法初步观察南京地区部分胃肠疾病患者中具有ｃａｇＡ、ｖａｃＡ基因幽门螺杆菌（ＨＰ）菌株感染状况。结果显示，具有ｃａｇＡ、ｖａｃＡ基因的ＨＰ菌株在消化性溃疡患者中的感染率为７５％、慢性胃炎为４０．９％、胃癌为５０％，表明在南京地区消化性溃疡患者ｃａｇＡ＋、ｖａｃＡ＋的ＨＰ菌株感染高于慢性胃炎者（χ２＝９．４３，Ｐ＜０．０１），提示具有ｃａｇＡ、ｖａｃＡ的ＨＰ菌株可能更具有致病性。

具有cagA、vacA基因的幽门螺杆菌与胃肠疾病

Hp感染后可导致不同的临床及病理结果，受感染者可形成慢性胃炎、胃或十二指肠球部溃疡、甚至胃癌。造成上述不同结果的机制尚不清楚。近年随着分子生物学技术的发展及应用，认为Hp’菌株中cagA、vacA基因的存在与表达可能与上述结果的形成有关。本文就cagA、vacA基因的检测及其在胃肠疾病中的致病作用作一综述。

幽门螺杆菌vacA基因多态性与慢性胃病的关系

目的探讨幽门螺杆菌(Hp)vacA 基因多态性与慢性胃病的关系。方法经胃镜检查活检胃粘膜标本,分离鉴定 Hp,酚氯仿方法抽提 DNA,聚合酶链反应检测 vacA 基因的信号区(s)和中间区(m)。结果 92例 Hp 临床分离株中,sla/ml 型14株(15.2%)、sla/mla 型6株(6.5%)、sla/m^2型55株(59.8%)、slb/ml 型2株(2.2%)、sla/m2型5株(5.4%)、s2/m2型8株(8.7%),另有2株 sla 型 Hp 不通按 ml、mla 或 m2进一步分型,未发现 s2/ml、slb/mla 及 S2/mla 型。除4例胃癌外,其余88例按消化性溃疡和慢性胃炎分组,40例消化性溃疡患者感染 Hp 中 sla 型37株,占92.5%,slb 型2株(5%),s2型1株(2.5%);ml 型4株(10%),mla 型2株(5%),m2型32株(80%),另有2株 sla 型 Hp 未能按 ml、mla 或 m2进一步分型。48例慢性胃炎患者感染Hp 中 sla 型36株,占75%,slb 型5株(10.4%),s2型7株(14.6%);ml 型11株(22.9%),mla 型4株(8.3%),m2型33株(68.8%)。消化性溃疡组慢性胃炎组均以 sla 型、m2型为主,分别比较两组间 sla 型及 m2型的分布,两组间 sla 型有显著性差异(P<0.05),而 m2型无显著性差异(P>0.05)。结论慢性胃病患者感染 Hp 主要为 sla/m2型,其次为 sla/ml 型。sla 型 Hp 与消化性溃疡的发生密切相关。

幽门螺杆菌vacA基因分型与毒素活性关系的研究进展

vacA基因编码VacA毒素,VacA毒素是幽门螺杆菌产生的重要毒力因子,使细胞发生空泡变性,vacA基因信号序列和中区序列的不同可在各菌株间表现为五种不同的基因表现型,各型与毒素的活性关系密切,主要是由于不同细胞表面有针对毒素的各型特异性受体,VacA毒素显示了两个不同的受体结合点。VacA毒素只有同细胞粘附、被细胞内化才能产生空泡毒作用。

中国幽门螺杆菌vacA基因型标签序列与VacA活性关系的分子系统发育分析

目的探讨中国幽门螺杆菌vacA基因s、m和i区氨基酸序列分子系统发育关系及其对VacA活性的影响。方法从GenBank数据库中下载所有中国幽门螺杆菌VacA全长氨基酸序列,利用ClustalX 2.0和MEGA 5.05软件对vacA基因s、m和i区氨基酸序列及VacA全长氨基酸序列进行生物信息学分析,构建分子系统发育树。结果中国幽门螺杆菌无毒弱毒株vacA基因型全为s1/m2/i1型,而强毒株除Ch2菌株为m1-m2杂合型之外,全为s1/m1/i1型,s1型和i1型强相关。分子系统发育分析显示,中国幽门螺杆菌vacA基因s、m和i区氨基酸序列都呈现明显的地理特异性,其中m区分子系统发育树能够将VacA强毒株和无毒弱毒株分开,而s和i区分子系统发育树则不能将两者完全分开。结论 vacA基因m区氨基酸序列更适合作为中国幽门螺杆菌VacA的毒力标志。