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人血管内皮生长因子受体Flt-1胞外区2-3loop在Pichia.pastoris酵母中的表达、纯化及其生物学活性研究 被引量:5
1
作者 马骊 王小宁 +3 位作者 张智清 周小明 曾革非 陈爱君 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第2期61-65,共5页
目的 :研究人Flt 1胞外区 2 3loopcDNA在Pichia pastoris酵母中的表达 ,获得高效表达的具有生物学活性的重组Flt 1(2 3)。方法 :采用PCR扩增Flt 1(2 3)基因 ,经DNA序列分析后 ,插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的Pichia pastoris... 目的 :研究人Flt 1胞外区 2 3loopcDNA在Pichia pastoris酵母中的表达 ,获得高效表达的具有生物学活性的重组Flt 1(2 3)。方法 :采用PCR扩增Flt 1(2 3)基因 ,经DNA序列分析后 ,插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的Pichia pastoris酵母表达载体中 ,构建重组质粒pPIC9K Flt 1(2 3) ,转化酵母宿主菌GS115 ,筛选His+ Muts 表型转化子 ,摇瓶培养 ,1%甲醇诱导表达。表达产物经CM SepharoseFF阳离子交换层析和SephacrylS 10 0分子筛层析纯化后 ,测定其生物学活性。结果 :SDS PAGE分析显示 ,表达产物以可溶性分子形式存在于上清中 ,诱导 4d的表达量达上清总蛋白的 6 0 %以上。ELISA及Westernblot实验表明 ,表达产物具有良好的抗原性和特异性。经CM SepharoseFF阳离子交换层析和SephacrylS 10 0分子筛层析纯化后 ,Flt 1(2 3)纯度达到 90 %以上。生物学活性检测证实其具有结合hVEGF1 6 5 的能力和抑制hVEGF1 6 5 对HUVEC的促增殖功能。结论 :获得了具有生物学活性的可溶性重组Flt 1受体胞外区 2 3loop小片段 ,为进一步的动物实验和临床应用打下了基础。 展开更多
关键词 血管内皮生长因子 flt-1 基因表达 pichia.PASTO
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Expression and Characterization of the Recombinant Human FLT-3 Ligand Extracellular Domain in Pichia Pastoris
2
作者 Zongtang Huang Xishan Hao 《Chinese Journal of Clinical Oncology》 CSCD 2006年第6期400-407,共8页
OBJECTIVE The FLT-3 ligand (fms-like tyrosine kinase receptor-3 ligand, FL) is a recently described growth factor affecting early hematopoietic progenitor cells. The FL plays a key role in the growth and differentia... OBJECTIVE The FLT-3 ligand (fms-like tyrosine kinase receptor-3 ligand, FL) is a recently described growth factor affecting early hematopoietic progenitor cells. The FL plays a key role in the growth and differentiation of primitive hematopoietic cells. To yield a high-level of recombinant human FL protein, a recembinant Pichia Pastoris (P. pastoris)strain was constructed. METHODS An artificial expression frame, with the same encoding protein sequence for the FL extracellular domain cDNA, was synthesized by using favored genetic codons of P. pastoris. P. pastoris strain KM71 cells were transformed with the endonuclease Bgl II linearized recombined plasmid, pPIC9K-FL. The plasmid then was linerized in the 5'AOX1 site and integrated into the yeast KM71 genome. KM71 was transformed with pPIC9K plasmids as a control for the production of recombinant protein. Southern blotting and Northern blotting tests were used to screen the genotype of the recombined strain. Biological activity was demonstrated in vitro with culturing of CD34+cells. RESULTS The recombinant human FL protein expressed into the yeast culture supertant was identified on the basis of its molecular weight and Western blotting analysis. Numerous bands were observed in the 10-100 kDa molecular mass range. SDS-PAGE showed that the expressed product, a 20 kDa protein, was secreted into the medium in the form of a soluble molecule. Western-blot analyses showed good antigenicity and specificity against polyclonal antibodies. A sharp band and a smeared band were observed at a molecular mass of approximately 20 kDa by Western blotting. The recombinant human FL protein was the major protein component observed in the culture supernatant. The highest yield (108 mg/L) was obtained when expression was induced with 0.5% methanol for 96 h. Deglycosylation with PNGase F resulted in a decrease in apparent molecular mass from 20 kDa to 18kDa forming three bands all of which were also detected by rabbit anti-FL antibodies, Culturing of CD34+ cells in the presence of KM71pPIC9K-FL over 7 days increased 2.9 fold, while in the control group they increased only 1,5 fold. The biological assay showed that the expressed product could stimulate the proliferation of CD34+ hematopoietic cells, CONCLUSION We demonstrated that human FL was secreted into the culture supernatant from P. pastoris, and that this yeast strain was a preferred host for recombinant human FL gene expression. This recombinant strain can provide a convenient process for pharmaceutical application. 展开更多
关键词 expression RECOMBINANT human flt-3 ligand extmcellular domain pichia pastoris.
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Cloning and Expression of Recombinant Human Thymosin in Yeast Pichia pastoris
3
作者 曹俊霞 Jin +4 位作者 Liji Duan Yanlong An Lijia 《High Technology Letters》 EI CAS 2003年第3期60-64,共5页
The gene of human thymosin alpha 1(hT(1)was synthesised according to favorite codons of Pichia pastoris by PCR. N-terminal 28 amino acid residues of 40S ribosomal protein (RP), S24E that is N-acetylserine were replace... The gene of human thymosin alpha 1(hT(1)was synthesised according to favorite codons of Pichia pastoris by PCR. N-terminal 28 amino acid residues of 40S ribosomal protein (RP), S24E that is N-acetylserine were replaced by hT(1 for the constitution of hT(1-RP fusion gene in order to express acetyllated thymosin α 1. And also,the Asn-Gly bond was designed to faciliate isolation of the target protein.The fusion gene was cloned into the expression vector, pPIC/9K. The constructs were transformed into HIS4 mutant strain GS115 by electroporation. Both SDS-PAGE analysis and Western blot analysis indicated that the fusion protein was expressed successfully. 展开更多
关键词 expression human thymosin α 1 pichia pastoris
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人hIGF-1在Pichia pastoris酵母中的分泌表达及表达产物的鉴定
4
作者 彭鸿娟 李明 +3 位作者 杨林 陈晓光 陈新华 王珣章 《中山大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2000年第z2期44-47,共4页
根据人ICF-1(Human Insulin-like Growth Factor-1,hIGF-1)的天然基因序列,在尽量保存原基因序列的基础上,将一些密码子换成Pichia pastoris酵母的偏爱密码子,人工合... 根据人ICF-1(Human Insulin-like Growth Factor-1,hIGF-1)的天然基因序列,在尽量保存原基因序列的基础上,将一些密码子换成Pichia pastoris酵母的偏爱密码子,人工合成hIGF-1双链DNA.将此合成基因整合人X-33酵母的染色体上,用Zeocin+平板筛选得到重组菌株.以胞外分泌的方式表达了hIGF-1蛋白,表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳和western-blot分析,得到该表达产物的相对分子质量约为7200. 展开更多
关键词 HIGF-1 pichia pastoris 表达
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HIV-1外膜蛋白gp120在酵母Pichia pastoris中的表达
5
作者 冯劼 朱娟莉 +1 位作者 董兆麟 陈超 《西北大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期801-804,813,共5页
目的用巴斯德毕赤酵母系统表达HIV外膜糖蛋白gp 120。方法将从HIV-1型国际标准株pHXB2-gp 160的基因序列中扩增出的gp 120分子的长片段基因(1 419 bp)和短片段基因(417bp)分别克隆入真核表达载体pPICZαA与pPICZB中,以电穿孔法转化酵母G... 目的用巴斯德毕赤酵母系统表达HIV外膜糖蛋白gp 120。方法将从HIV-1型国际标准株pHXB2-gp 160的基因序列中扩增出的gp 120分子的长片段基因(1 419 bp)和短片段基因(417bp)分别克隆入真核表达载体pPICZαA与pPICZB中,以电穿孔法转化酵母GS 115。用YPDS-zeo平板筛选重组子、PCR方法检测整合到酵母菌GS 115基因组中的gp 120片段基因,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物。结果诱导后gp 120短片段多肽在GS 115中少量表达,在诱导表达24 h重组蛋白表达量及抗原性达到最高,表达产物被降解,具有良好的抗原特异性。诱导后gp 120长片段多肽未被GS 115所表达。结论在巴斯德毕赤酵母中成功表达gp 120分子长片段需要优化gp 120基因,为制备HIV-1的诊断抗原和基因工程重组疫苗打下基础。 展开更多
关键词 人免疫缺陷病毒I型 GP 120 基因克隆 蛋白表达 毕赤酵母
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人可溶性血管内皮细胞生长因子(VEGF)受体Flt-1基因在甲醇酵母中的克隆表达
6
作者 姜自彬 王丽非 李元 《药物生物技术》 CAS CSCD 2002年第3期123-127,共5页
应用RT-PCR技术,从人脐静脉内皮细胞中扩增出编码Flt-1胞外区前四个结构域的基因片段,将Flt-1基因片段连接到表达载体pPIC9K上,获得重组质粒pPIC9K-F,将重组质粒转化到甲醇酵母Pichia pastorisGS115中,得到基因工程菌株 P.pastoris(pP... 应用RT-PCR技术,从人脐静脉内皮细胞中扩增出编码Flt-1胞外区前四个结构域的基因片段,将Flt-1基因片段连接到表达载体pPIC9K上,获得重组质粒pPIC9K-F,将重组质粒转化到甲醇酵母Pichia pastorisGS115中,得到基因工程菌株 P.pastoris(pPIC9K-F),对培养卜清进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果显示在74.2 ku处有阳性条带出现,表明sFLT-1在甲醇酵母中获得了成功表达。受体配基结合实验显示表达产物与VEGF可特异性结合,表明其具有配基结合生物活性。 展开更多
关键词 血管内皮细胞生长因子 可溶性受体flt-1 甲醇酵母 基因表达 逆反转聚合酶链式反应
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VEGF_(165)cDNA在酵母中的表达、纯化及其生物学活性研究 被引量:6
7
作者 马骊 王小宁 +3 位作者 张智清 陈爱君 姚立红 姜忠良 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第1期24-28,共5页
目的研究人 VEGF165基因在 Pichia pastoris酵母中的表达,获得高效表达、具有生物学活性的重组hVEGF165。方法采用PCR扩增hVEGF165基因,经DNA序列分析后,插入含AOX1启动子和α分泌... 目的研究人 VEGF165基因在 Pichia pastoris酵母中的表达,获得高效表达、具有生物学活性的重组hVEGF165。方法采用PCR扩增hVEGF165基因,经DNA序列分析后,插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的Pichia pastoris酵母表达载体中,构建重组质粒pPIC9K/hVEGF165。经转化酵母宿主菌KM71,筛选多拷贝整合转化子,摇瓶培养,用 10 mL/L甲醇诱导表达。表达产物经Heparin-Sepharose CL6B亲和层析纯化后,以人脐静脉内皮细胞(HUVEC)测定其生物学活性。结果SDS-PAGE分析显示,表达产物以可溶性分子的形式存在于上清中,诱导4d的表达量达上清中总蛋白的60%以上。 Western blot表明,表达产物具有良好的抗原性和特异性。经Hep-arin-Sepharose CL6B亲和层析纯化, rhVEGF165的纯度可达到90%以上。生物学活性检测证实,其具有刺激脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的活性。结论在 Pichia pastoris表达系统中,实现了hVEGF165的高效分泌性表达。 展开更多
关键词 血管内皮生长因子 毕赤巴斯德酵母
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人血管内皮细胞生长因子受体Flt-1胞外区cDNA在毕赤酵母中的表达和鉴定 被引量:2
8
作者 马骊 张智清 +4 位作者 周小明 曾革非 陈爱君 姚立红 王小宁 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2000年第4期447-450,共4页
将编码血管内皮细胞生长因子受体Flt 1胞外区 1 3loop 316个氨基酸残基的cDNA插入到含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的Pichiapastoris酵母载体中 ,构建了重组表达质粒 pPIC9K/Flt 1(1 3) ,转化酵母宿主菌GS115 ,筛选His+ Muts 表型转化... 将编码血管内皮细胞生长因子受体Flt 1胞外区 1 3loop 316个氨基酸残基的cDNA插入到含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的Pichiapastoris酵母载体中 ,构建了重组表达质粒 pPIC9K/Flt 1(1 3) ,转化酵母宿主菌GS115 ,筛选His+ Muts 表型转化子 ,经摇瓶培养 ,1%甲醇诱导表达 4d后 ,SDS PAGE结果显示 ,培养上清中Flt 1(1 3)表达量达总蛋白的 30 %以上。ELISA及Westernblot实验表明 ,表达产物具有良好的抗原性和特异性。生物学活性检测证实其具有结合VEGF的能力和抑制VEGF对HUVEC细胞的促增殖功能。 展开更多
关键词 血管内生长因子 FIt-1 酵母表达系统 鉴定
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在毕赤酵母中表达的重组人血管内皮生长因子(rhVEGF_(121))为氨基端4个氨基酸缺失的异构体
9
作者 陈工 马晓骊 +2 位作者 陈虹 王欣 黄秉仁 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 2004年第3期67-72,共6页
为获得重组人血管内皮生长因子 ,采用重叠PCR扩增出含Kozak顺序、α因子前导肽和hVEGF12 1的融合基因 ,经DNA测序无误后 ,插入Pichiapastoris酵母载体 ,并体外构建 4拷贝表达单元质粒pAO81 5 4KαVEGF12 1。表达载体转化酵母宿主菌GS1 ... 为获得重组人血管内皮生长因子 ,采用重叠PCR扩增出含Kozak顺序、α因子前导肽和hVEGF12 1的融合基因 ,经DNA测序无误后 ,插入Pichiapastoris酵母载体 ,并体外构建 4拷贝表达单元质粒pAO81 5 4KαVEGF12 1。表达载体转化酵母宿主菌GS1 1 5 ,筛选出高效表达hVEGF的转化子。摇瓶培养并 1 %甲醇诱导 80h的VEGF分泌性表达量可达 30mg L。表达产物经S Sepharose离子交换层析纯化后测活表明表达产物二聚体具有良好生物活性。SDS PAGE分析、Western印迹表明表达产物具有适宜的分子量和抗原性。VEGF蛋白经氨基端氨基酸测序证实纯化后的不同糖化程度产物为同一蛋白质 ,但均为氨基端缺失了 4个氨基酸的全长为 1 1 7个氨基酸的VEGF。 展开更多
关键词 毕赤酵母 表达 重组人血管内皮生长因子 氨基酸
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Enhancing ergosterol production in Pichia pastoris GS115 by overexpressing squalene synthase gene from Glycyrrhiza uralensis 被引量:3
10
作者 LIU Ying ZHU Xiao-Qing +2 位作者 LI Wen-Dong WEN Hao LIU Chun-Sheng 《Chinese Journal of Natural Medicines》 SCIE CAS CSCD 2015年第5期338-345,共8页
The present study was designed to determine the effects of copy number variations(CNVs) of squalene synthase 1(SQS1) gene on the mevalonate(MVA) pathway.SQS1 gene from G.uralensis(Gu SQS1) was cloned and over-expresse... The present study was designed to determine the effects of copy number variations(CNVs) of squalene synthase 1(SQS1) gene on the mevalonate(MVA) pathway.SQS1 gene from G.uralensis(Gu SQS1) was cloned and over-expressed in Pichia pastoris GS115.Six recombinant P.pastoris strains containing different copy number of Gu SQS1 were constructed.HPLC was used to assay the level of ergosterol in all transgenic P.pastoris strains containing Gu SQS1.HPLC analysis showed that the contents of ergosterol in all of the transgenic P.pastoris containing Gu SQS1 were higher than that in the negative control.And with the increase of copy number of Gu SQS1,the content of ergosterol showed an increasing-decreasing-increasing pattern.The contents of ergosterol in 10-copy-Gu SQS1 P.pastoris and 47-copy-Gu SQS1 P.pastoris were significantly higher than that in the rest recombinant P.pastoris strains.In conclusion,the CNVs of Gu SQS1 influence the content of secondary metabolites in the MVA pathway.The present study provides a basis for over-expressing Gu SQS1 and increasing the content of glycyrrhizin in G.uralensis cultivars. 展开更多
关键词 Glycyrrhiza uralensis GuSQS1 OVER-expression pichia pastoris Copy number variations
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gsh 1基因的克隆及其在巴斯德毕赤氏酵母中的表达 被引量:5
11
作者 饶志明 艾丽静 +2 位作者 沈微 方慧英 诸葛健 《应用与环境生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期257-260,共4页
利用PCR技术克隆了来源于Saccharomyces cerevisiae ALJ036的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶(γ-glutamyl-cysteine synthetase)编码基因gsh1,连接多拷贝表达载体pGAPZA,转化Pichia pastorisx-33,构建了重组菌P.pastorisx-33(pGAPZA-gsh... 利用PCR技术克隆了来源于Saccharomyces cerevisiae ALJ036的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶(γ-glutamyl-cysteine synthetase)编码基因gsh1,连接多拷贝表达载体pGAPZA,转化Pichia pastorisx-33,构建了重组菌P.pastorisx-33(pGAPZA-gsh1);在高浓度Zeocin平板上筛选多拷贝阳性转化子,并通过PCR进行了验证.对阳性转化子的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶酶活力进行了测定,结果显示,重组酵母的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶的酶活是宿主菌的3.0倍,在液体YEPD中重组菌GSH的产量为42.2mg/L,是宿主菌的1.6倍. 展开更多
关键词 GSH 1 巴斯德毕赤氏酵母 克隆 表达 谷胱甘肽 γ- 谷氨酰半胱氨酸合成酶
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鸡β-防御素-1 cDNA的克隆及在毕赤酵母中的表达 被引量:11
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作者 张辉华 毕英佐 +1 位作者 曹永长 马静云 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第8期767-772,共6页
从鸡骨髓细胞中分离提取总RNA,经过反转录PCR(RT-PCR)扩增出鸡β-防御素-1(Gallinacin-1,Gal-1)cDNA,将扩增产物与pGEM-TEasy载体相连,经克隆测序表明扩增出的cDNA碱基数为198bp,与报道的Gal-1cDNA编码区碱基序列完全相同。分析核苷酸... 从鸡骨髓细胞中分离提取总RNA,经过反转录PCR(RT-PCR)扩增出鸡β-防御素-1(Gallinacin-1,Gal-1)cDNA,将扩增产物与pGEM-TEasy载体相连,经克隆测序表明扩增出的cDNA碱基数为198bp,与报道的Gal-1cDNA编码区碱基序列完全相同。分析核苷酸序列表明Gal-1与火鸡异嗜性白细胞肽-1(Turkeyheterophilpep-tides,THP-1)具有85.4%同源性。氨基酸序列方面Gal-1与THP-1同源性最高,为72.7%。将Gal-1基因成熟肽片段插入到酵母表达载体pPICZ-αC,构建重组表达载体pPICZ-αC-gal-1,电转入表达宿主菌X-33,Zeocin抗性筛选重组菌株。挑取阳性菌株经甲醇诱导表达,Tricine-SDS-PAGE电泳发现在约4.5ku位置出现预期条带。对其抗菌活性检测发现具有抗大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等细菌的活性。反相高效液相色谱表明阳性菌株表达产物与标准品在层析柱中保留时间一致。 展开更多
关键词 β-防御素-1 克隆 毕赤酵母 表达
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犬α_1干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其抗病毒活性研究 被引量:10
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作者 曹瑞兵 王艳 +1 位作者 魏建超 陈溥言 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期107-112,共6页
亚克隆犬α1干扰素(CaIFN-α1)成熟蛋白编码基因并克隆到表达载体pPICZα-A,构建转移重组载体pPICZα-A-CaIFN-α。pPICZα-A-CaIFN-α经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33。转化子经PCR分析鉴定后利用甘油增菌和甲醇诱导,... 亚克隆犬α1干扰素(CaIFN-α1)成熟蛋白编码基因并克隆到表达载体pPICZα-A,构建转移重组载体pPICZα-A-CaIFN-α。pPICZα-A-CaIFN-α经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33。转化子经PCR分析鉴定后利用甘油增菌和甲醇诱导,实现了CaIFN-α1在毕赤酵母系统中的分泌表达。SDS-PAGE检测结果表明表达产物相对分子质量约为2.7×104,比其推导结果(约1.9×104)大,推测可能是发生了糖基化。酵母分泌表达的CaIFN-α1具有较高的抗病毒活性,约为1.45×106U·mL-1,蛋白含量约为96mg·L-1,比活性为1.49×107U·mg-1。重组CaIFN-α1的生物学活性具有较强的种属特异性,在犬肾细胞(MDCK)上具有很高的抗病毒活性,在鸡胚成纤维细胞上活性较低,而在猫肾细胞(F81)和牛肾细胞(MDBK)上几乎没有抗病毒活性。进一步研究发现,重组犬α1干扰素对犬瘟热病毒和伪狂犬病毒在犬肾细胞中的增殖具有显著抑制作用。 展开更多
关键词 犬α干扰素 毕赤酵母 分泌表达 抗病毒活性
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新型抗HIV-1重组导向制剂SL41在毕赤酵母中的表达及活性实验 被引量:8
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作者 李昌 王宏 +5 位作者 金宁一 金洪涛 刘玉生 于芳 李子健 张立树 《高等学校化学学报》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2007年第8期1493-1496,共4页
以酵母分泌型表达载体pPIC9k为基础,通过一段柔性连接肽Linker构建含有人源化抗HIV-1 gp41单链抗体(ScFv41)和免疫诱导因子葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxinA,SEA)的融合表达质粒pPIC9k-SL41,线性化后,采用电转化法整合入巴... 以酵母分泌型表达载体pPIC9k为基础,通过一段柔性连接肽Linker构建含有人源化抗HIV-1 gp41单链抗体(ScFv41)和免疫诱导因子葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxinA,SEA)的融合表达质粒pPIC9k-SL41,线性化后,采用电转化法整合入巴斯德菌毕赤酵母GS115中,经His+MutS表型鉴定、PCR分析以及G418筛选获得高拷贝重组转化子.摇瓶培养、甲醇诱导表达、SDS-PAGE和Western Blot分析结果表明,目的蛋白得到良好表达,表达量最高可达到47.9 mg/L.目的蛋白经初步纯化后,用于制备的HIV-1感染靶细胞复制模型进行抗体亲和力测定、细胞结合活性测定和细胞杀伤活性研究,结果显示,目的蛋白能够很好地与靶细胞模型中的HIV-1外膜蛋白gp160发生结合反应,并可介导特异的CTL反应,对靶细胞具有明显的杀伤活性,表明获得了具有生物活性的抗HIV-1重组导向制剂. 展开更多
关键词 HIV-1 重组导向制剂 单链抗体 金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA) 分泌表达 毕赤酵母
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中国株HIV-1结构蛋白基因gag与gp120在巴斯德毕赤酵母中的融合表达 被引量:3
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作者 江文正 金宁一 +2 位作者 王宏伟 张应玖 金洪涛 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第5期426-428,共3页
目的 将中国流行株B亚型HIV 1结构蛋白基因gag和 gp12 0在巴斯德毕赤酵母中进行融合表达。 方法 以酵母分泌型表达质粒 pPIC9为载体 ,构建含HIV 1gag和gp12 0嵌合基因的重组酵母表达质粒pPICGP。用SacI将pPICGP线性化后 ,电转化巴斯... 目的 将中国流行株B亚型HIV 1结构蛋白基因gag和 gp12 0在巴斯德毕赤酵母中进行融合表达。 方法 以酵母分泌型表达质粒 pPIC9为载体 ,构建含HIV 1gag和gp12 0嵌合基因的重组酵母表达质粒pPICGP。用SacI将pPICGP线性化后 ,电转化巴斯德毕赤酵母GS115 ,用PCR的方法鉴定阳性酵母转化子。阳性转化子在巴斯德毕赤酵母中用甲醇进行诱导表达 ,表达产物以SDS PAGE和West ernblot进行分析 ,并对阳性菌株的遗传稳定性进行研究。结果  12个酵母转化子中共筛选到了 8个阳性酵母转化子 ,其整合率为 6 6 .7%。SDS PAGE和Westernblot分析显示 ,在相对分子质量 (Mr)为 5 70 0 0处有 1条特异蛋白带 ,且能与抗p2 4单抗 (mAb)和抗 gp12 0mAb发生反应。酵母转化子在YPD培养基上传代 10次后 ,其外源基因未丢失。结论 在巴斯德毕赤酵母中成功地表达了HIV 1gag gp12 0嵌合基因 ,且表达蛋白具有特异性 ,但其Mr较预计计算的值要小 ,说明嵌合基因中的 gp12 展开更多
关键词 HIV-1 结构蛋白 毕赤巴斯德酵母 融合表达 人工型 免疫缺陷病毒
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产琥珀酸丝状杆菌1,3-1,4-β-葡聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达 被引量:6
16
作者 杨玉霞 张慧玲 +1 位作者 汪艳 陈勇 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期123-130,共8页
为实现瘤胃细菌产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)1,3-1,4-β-葡聚糖酶基因(FsGLU)的高效表达,开发新的饲用β-葡聚糖酶资源,根据毕赤酵母对密码子的偏爱性、G+C含量等特点,对FsGLU基因进行密码子优化,然后合成优化后的1... 为实现瘤胃细菌产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)1,3-1,4-β-葡聚糖酶基因(FsGLU)的高效表达,开发新的饲用β-葡聚糖酶资源,根据毕赤酵母对密码子的偏爱性、G+C含量等特点,对FsGLU基因进行密码子优化,然后合成优化后的1,3-1,4-β-葡聚糖酶基因(FsGLUm),转化毕赤酵母GS115,以甲醇诱导表达并对重组FsGLUm的酶学特性、底物特异性和对消化酶的耐受性进行了研究。结果表明:摇瓶水平条件下,以甲醇诱导表达48 h时,重组FsGLUm酶活性提高25.1%(P〈0.05)。在10 L发酵罐中诱导96 h后,重组FsGLUm的活性为6 424 U·mL-1,菌体湿质量和干质量达到274.6和123.6 g·L-1。酶学特性分析表明:纯化后的重组FsGLUm最适反应温度为37℃,最适反应pH值为5.0,比活性为10 397 U·mg-1。在温度低于37℃、pH 5.0~6.5时该酶具有较好的稳定性。底物特异性分析表明:重组FsGLUm可水解大麦β-葡聚糖和地衣多糖,不降解燕麦木聚糖、桦木木聚糖和羧甲基纤维素钠。在胃蛋白酶和胰蛋白酶共同作用60 min后,仍保留了50.5%的酶活性。结论:FsGLU基因在毕赤酵母GS115中实现了高效表达,重组FsGLUm作为饲用酶制剂具有潜在的应用价值。 展开更多
关键词 产琥珀酸丝状杆菌 1 3-1 4-β-葡聚糖酶基因 毕赤酵母 基因表达 酶学性质
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抗HIV-1外膜蛋白单链抗体基因的酵母表达和生物活性分析 被引量:4
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作者 李昌 金宁一 +4 位作者 王宏伟 刘玉生 于芳 佟敬山 胡宁宁 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第12期1144-1146,共3页
目的:构建含抗HIV-1外膜蛋白gp120单链抗体(scFv)基因的酵母表达载体,实现目的蛋白的分泌性表达,并检测其生物活性。方法:采用基因工程和重组DNA技术,从质粒pET28-scFv中切下目的基因片段,定向克隆入毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9的相应... 目的:构建含抗HIV-1外膜蛋白gp120单链抗体(scFv)基因的酵母表达载体,实现目的蛋白的分泌性表达,并检测其生物活性。方法:采用基因工程和重组DNA技术,从质粒pET28-scFv中切下目的基因片段,定向克隆入毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9的相应位点,构建重组酵母表达质粒pPIC9-scFv。BglⅡ线性化后,电转化入受体酵母菌GS115中,筛选阳性重组子,进行甲醇诱导表达,并用RT-PCR、SDS-PAGE、双抗体夹心Dot-ELISA法分析目的蛋白表达情况。结果:通过表型筛选、PCR鉴定获得阳性重组酵母工程菌,RT-PCR、SDS-PAGE分析表明目的蛋白得到很好表达,表达量可占培养液上清总蛋白量的18%,双抗体夹心Dot-ELISA法检测,表达产物能够特异识别重组HIV-1gp120抗原蛋白并与之发生特异性免疫反应,证明表达的重组scFv具有良好的抗体活性。结论:成功地实现了scFv基因的分泌性表达,为抗AIDS靶向治疗及进一步研究其抗HIV活性提供了依据。 展开更多
关键词 HIV-1 外膜蛋白 单链抗体 酵母分泌表达
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mMR-1基因的克隆和在毕赤酵母中分泌表达 被引量:3
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作者 李天伯 胡洋 +1 位作者 王以光 夏焕章 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期25-29,共5页
hMR 1为本实验室首次克隆发现的一个人类新基因 ,是一种和三种肌肉收缩蛋白及多种细胞信号蛋白具有相互作用的膜蛋白。经与鼠基因组数据库进行同源分析后设计合成引物 ,利用RT PCR技术从小鼠C5 7BL 6J脾脏T淋巴细胞总RNA中反转录得到鼠... hMR 1为本实验室首次克隆发现的一个人类新基因 ,是一种和三种肌肉收缩蛋白及多种细胞信号蛋白具有相互作用的膜蛋白。经与鼠基因组数据库进行同源分析后设计合成引物 ,利用RT PCR技术从小鼠C5 7BL 6J脾脏T淋巴细胞总RNA中反转录得到鼠源MR 1基因 (mMR 1) ,提交GenBank ,收录号 (AY2 99972 )。序列分析证明其与人源MR 1基因 (hMR 1)同源性为 90 1%。构建表达载体pPIC9 mMR 1电转化PichiapastorisGS115 ,筛选得到整合分泌表达mMR 1蛋白的重组酵母菌株。表达目的蛋白分子量 2 5kD ,诱导 5d时产量达到 5 0mg L ,通过Westernblot验证了表达产物的正确性。本研究为进一步研究新基因MR 1的生物学功能奠定了基础。 展开更多
关键词 MR-1 克隆与表达 毕赤酵母
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人TALL-1基因在毕赤酵母中的分泌表达与鉴定 被引量:2
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作者 王蒙 杨媛 +4 位作者 杨峥嵘 李广阔 刘晓红 粟永萍 程天民 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第6期494-497,共4页
目的研究在毕赤酵母(Pichia Pastoris)系统中人TALL-1基因的分泌表达,获得具有生物活性的重组TALL-1。方法将人TALL-1基因插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的酵母表达载体pPIC9K中,用SacⅠ将重组质粒线性化,电转化Pichia Pastoris GS... 目的研究在毕赤酵母(Pichia Pastoris)系统中人TALL-1基因的分泌表达,获得具有生物活性的重组TALL-1。方法将人TALL-1基因插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的酵母表达载体pPIC9K中,用SacⅠ将重组质粒线性化,电转化Pichia Pastoris GS115感受态细胞,筛选阳性整合子并进行甲醇诱导表达,采用MTT对表达产物进行初步的生物活性检测。结果经过诱导表达条件的优化,人TALL-1在酵母培养基BMMY中实现了分泌表达;免疫印迹和酶联免疫检测结果显示,重组产物可以结合其特异抗体;生物学活性检测证实其可抑制Hela细胞增殖。结论在毕赤酵母系统中实现了人TALL-1的分泌表达,具有生物学活性的重组TALL-1分子可以用于进一步的结构与功能研究。 展开更多
关键词 TALL-1 分泌表达 毕赤酵母
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恶性疟原虫AMA-1(Ⅲ)基因在毕赤酵母系统中的高效表达 被引量:4
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作者 张忠广 赵恒梅 宫玉香 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2005年第3期240-243,共4页
目的 利用毕赤酵母高效表达系统表达用于下游实验的恶性疟原虫AMA - 1(Ⅲ )重组蛋白。方法 将测序正确的AMA - 1(Ⅲ )基因插入毕赤酵母分泌型表达载体 pPIC9k中 ,用高压电穿孔转化法将目的基因转化入酵母感受态细胞GS115 ,筛选高拷贝... 目的 利用毕赤酵母高效表达系统表达用于下游实验的恶性疟原虫AMA - 1(Ⅲ )重组蛋白。方法 将测序正确的AMA - 1(Ⅲ )基因插入毕赤酵母分泌型表达载体 pPIC9k中 ,用高压电穿孔转化法将目的基因转化入酵母感受态细胞GS115 ,筛选高拷贝转化子 ,利用甲醇进行诱导表达。表达产物用SDS -PAGE和免疫印迹进行检测。结果 AMA - 1(Ⅲ )蛋白表达于培养上清 ,蛋白的相对分子质量分别为 16 .3ku ,免疫印迹结果表明AMA - 1(Ⅲ )基因表达蛋白能被抗AMA - 1(Ⅲ )的单抗所识别 ,出现特异条带 ,推算AMA - 1(Ⅲ )蛋白的表达量为 0 .8g/L。 结论 酵母细胞表达系统可高效表达在构象方面接近天然蛋白的AMA - 1(Ⅲ ) 展开更多
关键词 疟原虫 恶性 裂殖子顶端膜抗原1 疟疾疫苗 毕赤氏酵母
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