VEGF单克隆抗体在胰腺缺血再灌注损伤中的保护作用

目的:探讨VEGF单克隆抗体对胰腺缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)损伤的保护作用及其机制。方法:采用钳闭大鼠腹腔干、肠系膜上动脉制备胰腺缺血再灌注损伤模型。应用ELISA试剂检测VEGF,TNF-α表达,并应用TUNEL法检测胰腺细胞凋亡,RT-PCR,蛋白质印迹法和免疫组织化学染色检测胰腺组织中Fas,FasLmRNA和蛋白的表达情况。结果:I/R组血清中的TNF-α,VEGF明显高于VEGF单抗组(P<0.01)。I/R组胰腺组织中TUNEL染色见典型的细胞核固缩及凋亡小体形成。应用VEGF单克隆抗体后,胰腺组织中胰腺细胞凋亡指数明显下降。和I/R组相比,胰腺组织中Fas,FasL mRNA和蛋白表达水平均明显降低,免疫组化亦显示Fas,FasL在VEGF单抗组中显色弱于I/R组。结论:VEGF单克隆抗体可以降低I/R过程中TNF-α,VEGF表达水平,并且抑制Fas的表达,抑制过度凋亡,减轻缺血再灌注对胰腺的损伤。

VEGF单克隆抗体对胰腺缺血再灌注损伤中细胞凋亡的影响

目的:从胰腺腺泡细胞凋亡的角度探讨血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体在胰腺缺血再灌注损伤中保护作用。方法:采用钳闭大鼠腹腔干、肠系膜上动脉制备胰腺缺血再灌注损伤模型,并应用细胞凋亡原位标记法(TUNEL)、免疫组化技术等检测VEGF单克隆抗体干预后对胰腺细胞凋亡及Bax,Bcl-2蛋白表达的影响。结果:干预组15,30,60 min胰腺细胞凋亡指数显著低于缺血再灌注组(P<0.01)。正常胰腺组织未见凋亡调控基因Bcl-2的表达,VEGF单克隆抗体干预后15,30,60 min胰腺细胞Bcl-2染色阳性率明显高于缺血再灌注组(P<0.01);正常胰腺组织见较弱的凋亡调控基因Bax的表达,而VEGF单克隆抗体干预后15,30,60 min胰腺细胞Bax染色阳性率明显低于缺血再灌注组(P<0.01)。结论:VEGF单克隆抗体能够通过抑制胰腺腺泡细胞的过度凋亡减轻胰腺炎的严重程度,该作用可能是通过促进抗凋亡Bcl-2基因表达,抑制促进凋亡基因Bax表达来实现的。

抗KDR-Fc杂交瘤细胞系的建立

用杂交瘤技术建立抗KDRFc的杂交瘤细胞系,以KDRFc抗原免疫雌性BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经ELISA间接法检测和有限稀释法克隆培养,再经稳定性检测、效价检测,筛选出分泌抗KDRFc单克隆抗体的杂交瘤细胞.得到了10株能持续分泌抗KDRFc的单克隆抗体的细胞株,其中3株分泌的单抗具有较高的生物活性、特异性和稳定性.

中和性VEGF单抗的制备及其对肺癌的抑制作用

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)可诱导血管生成,对肿瘤的生长和转移至关重要。目前,VEGF已成为新药研发的主要靶标,这类新药可通过阻断微血管的形成和生长达到抑制肿瘤细胞的生长或是维持肿瘤处于休眠期的目的。该研究制备了中和性VEGF单克隆抗体(monoclonal antibody,Mc Ab)并探讨其对肺癌裸鼠模型血管生成的抑制作用。利用可编码VEGF全长蛋白的重组质粒免疫Balb/c小鼠,获得中和性VEGF Mc Ab,并利用VEGF±VEGF Mc Ab诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,Hu VEC)。通过Western blot法检测VEGFR-2磷酸化水平(活化状态),进而测定VEGF Mc Ab的中和性。VEGF Mc Ab可以抑制VEGF对VEGFR-2酪氨酸磷酸化的激活作用。该研究将A549肺癌细胞接种于裸鼠构建肿瘤模型,探讨了VEGF Mc Ab抗血管生成的效果。结果表明,50μg VEGF Mc Ab治疗组动物模型的瘤重抑制率为51.5%,瘤体抑制率为62.5%。VEGF Mc Ab不仅可以抑制VEGF对人脐静脉内皮细胞VEGFR-2介导的信号转导作用,且可有效抑制小鼠肺癌模型中肿瘤的生长。

血管内皮细胞生长因子受体KDR胞外配基结合区单抗对内皮细胞增殖及血管形成的抑制

目的 研制能封闭血管内皮生长因子 (VEGF)受体KDR的单克隆抗体 (McAb) ,探讨其抑制VEGF诱导的体内外活性。方法 以原核表达的KDRⅠ～Ⅳ区融合蛋白免疫BALB/c小鼠 ,用杂交瘤技术制备抗KDRⅠ～Ⅳ的McAb ,并用免疫双扩、ELISA和Western免疫印迹鉴定其亚类和抗原结合特异性 ,用VEGF刺激内皮细胞增殖及鸡胚血管形成实验检测该抗体的中和活性。结果 通过筛选和鉴定获得了 2株KDRⅠ～Ⅳ区McAbs(3G9、1E4) ,其分泌抗体亚类分别为IgG1和IgM。 2株McAb均能明显抑制VEGF诱导的内皮细胞 (EC)增殖 ,经纯化的McAb 3G9能明显抑制经VEGF刺激的鸡胚血管形成。结论 KDRⅠ～Ⅳ区McAb可能通过封闭内源性KDR而抑制VEGF活性 ,McAb 3G9具有潜在治疗肿瘤的应用前景。

人源化抗血管内皮生长因子单克隆抗体在CHO K1细胞中的表达及鉴定

目的 CHO K1细胞中表达人源化抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)单克隆抗体,并进行鉴定。方法采用电穿孔转染法将含编码人源化抗VEGF单克隆抗体轻、重链全基因的真核表达质粒DGV-K11转染至CHO K1细胞,经L-蛋氨酸亚砜(methionine sulfoxide,MSX)加压筛选和有限稀释克隆筛选,获得分泌表达人源化抗VEGF单克隆抗体的K11细胞株。利用生物反应器培养K11细胞,采用MabSelect SuRe、DEAE Sepharose FF和Eshmuno S凝胶色谱纯化培养液,以贝伐珠单抗(Bevacizumab)作为阳性对照,分析人源化抗VEGF单克隆抗体的纯度、电荷异质性、相对分子质量、N-末端序列、等电点及生物学活性。结果人源化抗VEGF单克隆抗体还原和非还原型CE-SDS分析图谱峰形及电荷异质性与阳性对照相似,轻、重链N-末端氨基酸序列一致;人源化抗VEGF单克隆抗体及阳性对照的SEC-HPLC单体纯度分别为97.46%和97.08%,完整相对分子质量分别为149 201.76和149 201.81,主峰等电点分别为7.31和7.32,生物学活性分别为0.993×10~4和0.960×10~4 U/mg。结论于CHO细胞中成功表达了人源化抗VEGF单克隆抗体,与贝伐珠单抗(Bevacizumab)具有相似的纯度、电荷异质性及生物学活性,本实验为CHO细胞大规模表达人源化抗VEGF单克隆抗体奠定了基础。