人血管内皮生长因子受体KDR胞外3区的表达与配体结合活性的鉴定

血管内皮生长因子受体(VEGFR)是血管内皮生长因子的特异性受体,VEGFR-2在介导VEGF刺激内皮细胞增殖及血管通透性等生物学活性中起重要作用。在大肠杆菌中实现可溶性的人血管内皮生长因子受体KDR胞外3区的表达,并鉴定其与配体结合的活性。采用重叠PCR的方法合成人血管内皮生长因子受体KDR胞外3区基因,将该基因与高效表达载体pET-32a重组,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)中,表达产物依次经过CM阳离子交换树脂和镍柱亲和层析纯化。利用ELISA法和体外抑制VEGF刺激的人脐静脉内皮细胞增殖实验检测表达产物与配体结合的活性。SDS-PAGE显示,目的蛋白主要以可溶性Trx-KDR3融合蛋白表达于胞质,30oC时1 mmol/L IPTG诱导细菌5 h融合蛋白表达量约占胞质可溶性总蛋白的20%,经CM阳离子交换树脂和镍柱亲合层析纯化得到纯度为95%的产物,Western blotting鉴定是目的蛋白。ELISA和体外HUVEC细胞增殖实验显示,表达产物具有特异性结合hVEGF165的活性,且该作用呈一定的浓度依赖性。具有配体特异性结合活性的可溶性人血管内皮生长因子受体KDR胞外3区成功表达,为靶向血管抗肿瘤治疗和相关抗体的研究奠定了基础。

血管内皮生长因子D基因的原核表达及纯化

利用GST融合基因表达系统原核表达血管内皮生长因子D,并进行纯化。诱导重组质粒pGEX-VEGF-D在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,经超声破菌后,采用GST蛋白纯化系统进行纯化,并用3C-Protease酶切去标签GST,所得产物进行15%SDS-PAGE电泳。结果表明:大肠杆菌经诱导,高效表达出分子质量约56 ku的GST-VEGF-D融合蛋白;纯化后的蛋白经酶切后电泳显示只有一条带,纯度相对较高,可基本满足生物学活性测定,为研究VEGF-D蛋白的结构和功能提供了有利的条件。