VEGF-C基因转染对人胃癌OCUM-2MD3细胞VEGF-C表达的影响

目的:探讨脂质体介导VEGF-C基因转染对人胃癌OCUM-2MD3细胞VEGF-C表达的影响。方法:双酶切pCRⅡ-VEGF-C重组质粒获得人VEGF-CcDNA片段,与真核表达载体pcDNA3.1连接构建pcDNA3.1-VEGF-C重组质粒,脂质体介导转染人胃癌OCUM-2MD3细胞并筛选,RT-PCR检测转染后VEGF-CmRNA表达水平,免疫组化法、流式细胞术检测VEGF-C蛋白表达变化。结果:经酶切鉴定,pcDNA3.1-VEGF-C重组质粒含人VEGF-CcDNA。转染组VEGF-CmRNA相对吸光度值为(0.73±0.16)%,较空载组(0.54±0.13)%表达显著上调(P<0.01)。免疫组化和流式细胞术检测转染组VEGF-C蛋白阳性表达率分别为(52.16±6.72)%、(41.83±3.65)%,较空载组(30.33±5.04)%、(30.16±3.23)%显著增加(P<0.01或0.05)。结论:脂质体介导VEGF-C基因转染人胃癌OCUM-2MD3细胞可显著增加VEGF-C表达水平,对探索胃癌淋巴转移机制及其治疗具有重要意义。

DPC_4基因转染结肠癌细胞对VEGF表达的影响

目的 研究DPC4基因转染人结肠癌细胞株SW 6 2 0对血管内皮生长因子 (VEGF)表达的影响。方法 利用DNA的限制性内切酶双酶切技术鉴定重组质粒PCDNA3 1 DPC4;利用脂质体介导转染技术和G4 18筛选得到稳定表达Smad4蛋白的DPC+ 4 SW 6 2 0 (PCDNA3 .1 DPC4转染的SW 6 2 0高转移性结肠癌细胞株 )细胞模型 ;采用Westernblot检测细胞中Smad4的表达 ;采用ELISA检测细胞上清液中VEGF的蛋白表达量 ;采用半定量逆转录多聚酶链反应RT PCR技术检测细胞中VEGF的mRNA表达量。结果 阳性质粒组DPC+ 4 SW6 2 0细胞的Smad4蛋白表达强于空白质粒组PCDNA3 .1 SW 6 2 0和未转染组SW6 2 0 ;DPC+ 4 SW 6 2 0组细胞上清液VEGF蛋白分泌明显减少 ,与PCDNA3 .1 SW 6 2 0组和SW 6 2 0组比较差异有显著性 (P <0 0 5 ) ,DPC+ 4 SW 6 2 0组细胞与PCDNA3 .1 SW6 2 0组细胞中VEGFmRNA半定量结果和SW6 2 0组比较 ,其表达量分别下降2 8 3%和 4 5 %。结论 DPC4可抑制人结肠癌细胞株SW 6 2 0中VEGF的表达。

超声微泡造影剂对心肌组织的生物学效应及介导VEGF基因转染大鼠心肌的实验研究

目的 探讨超声微泡造影剂对心肌组织的生物学效应及其介导VEGF基因转染大鼠心肌的有效性。方法 18只健康雄性Wistar大鼠 ,取 3只采用超声波在鼠胸壁破坏微泡造影剂 ,观察对心肌组织显微结构的影响。将另 15只急性心肌梗死 3天后的雄性Wistar大鼠分为 3组 ,每组 5只。第一组采用超声破坏微泡造影剂的方式 ,将pcD2 VEGF12 1基因转染大鼠心肌至造影剂不再显影 (约 6min) ;第二组尾静脉输入同等剂量携pcD2 VEGF12 1基因的造影剂 ;第三组为对照。 2周后 ,取缺血心肌组织行VEGF免疫组织化学染色 ,观察心肌组织血管内皮生长因子 (VEGF)蛋白表达情况。结果 超声波破坏微泡造影剂能使心肌组织充血 ,产生大量空泡 ,并有部分心肌细胞坏死。采用超声微泡造影剂介导的VEGF基因转染 ,能明显增强大鼠心肌组织VEGF蛋白的表达。结论 超声微泡造影剂能明显增强对组织的空化效应 ,其介导的VEGF基因治疗是一种无创、新型、高效的基因转移方法。

骨髓间充质干细胞的肌源性诱导分化及转染VEGF基因的表达

目的体外诱导兔骨髓间充质干细胞向肌源性细胞分化,并观察血管内皮生长因子AdTrackCMV-hVEGF165真核表达质粒转染骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)后的表达。方法将20只兔随机分为对照组和实验组,从骨髓液中分离MSCs,对照组以低糖DMEM培养,实验组加用5-氮胞苷(10 mmol/L)诱导培养,第28天进行肌钙蛋白I免疫组化染色。另构建AdTrackCMV-hVEGF165真核表达质粒,通过脂质体转染对照组MSCs,用Northern blotting和Western blotting鉴定血管内皮生长因子(VEGF)的表达,并用ELISA法测定培养上清液中VEGF的浓度。结果成功分离培养出兔MSCs,实验组经5-氮胞苷诱导后MSCs向肌源性细胞分化,肌钙蛋白I免疫组化染色阳性。成功构建AdTrackCMV-hVEGF165真核表达质粒并通过脂质体转染MSCs,Northern blotting示转染的MSCs VEGF165表达信号明显强于未转染细胞,Western blotting 示转染VEGF165基因的MSC表达VEGF,ELISA法测定培养上清液中VEGF的浓度在转染后第3天(1 011 pg/ml)和第5天(1 027 pg/ml)达高峰,此后逐渐下降,但至第13天(349 pg/ml)仍显著高于空白对照(116 pg/ml)和pAdTrackCMV组(125 pg/ml),P<0.01。结论兔骨髓间充质干细胞可在体外向肌源性细胞分化,转染VEGF基因可表达VEGF。

外源性RGS16基因稳定转染对胶质瘤C6细胞生长的影响

背景与目的:有研究表明野生型p53可以诱导RGS16表达,而RGS16可能与胶质瘤的发生有关。本研究旨在探讨RGS16基因转染对大鼠胶质瘤C6细胞生长的影响。方法:构建真核表达载体pIRES2-EGFP-RGS16,脂质体法转染C6细胞,经G418筛选后荧光显微镜观察细胞中增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorscentprotein,EGFP)的表达,RT-PCR证实RGS16的mRNA表达,免疫细胞化学方法检测细胞中RGS16蛋白表达。最后利用流式细胞仪、生长曲线、平板克隆形成等方法研究RGS16基因对胶质瘤细胞周期、生长及增殖的影响。结果:成功构建了稳定表达RGS16和表达空载体的细胞系C6-RGS16、C6-GFP。C6-RGS16、C6-GFP和C6经流式细胞仪检测S期的细胞比例分别为28.5%、18.9%和14.3%(P<0.05);生长曲线表明C6-RGS16生长的速度明显快于C6-GFP及C6,但其平板克隆形成率分别为12%、25%和25%(P<0.05)。结论:RGS16促进C6细胞周期从G1期向S期过渡,加快细胞生长速度,但是并不促进细胞克隆形成。

C_(215)抗原基因转染的瘤苗联合单抗与超抗原的融合蛋白C_(215)Fab-SEA的抗肿瘤作用初步研究

目的 :研究抗C2 1 5 单抗与超抗原———金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)的融合蛋白C2 1 5 Fab SEA与C2 1 5 抗原基因转染的瘤苗共同激发的抗肿瘤效应。方法 :以脂质体法将人大肠癌相关C2 1 5 抗原的基因转染B16小鼠黑色素瘤细胞系制备成瘤苗 ,建立C5 7BL 6小鼠黑色素瘤荷瘤模型 ,观察其与融合蛋白C2 1 5 Fab SEA对肿瘤生长的抑制作用。结果 :融合蛋白与瘤苗联合治疗组小鼠的抑瘤率明显高于单用融合蛋白组和单用瘤苗组 (P<0 0 1)。结论 :融合蛋白C2 1 5 Fab SEA与C2 1 5 抗原基因转染的瘤苗 ,两者的抗肿瘤效应能相互增强 ,其共同激发的免疫应答能控制荷瘤动物肿瘤的生长。

IL-18基因转染对大鼠C6胶质瘤细胞生长特性的影响

探讨IL-18基因转染对大鼠C6胶质瘤细胞生长特性的影响。用MTT法和流式细胞术检测C6/IL-18细胞和C6细胞的增殖特性和细胞周期分布。免疫细胞化学检测C6/IL-18细胞和C6细胞的增殖细胞核抗原(PCNA)、波形蛋白表达。结果显示,与C6细胞相比C6/IL-18细胞的增殖能力降低,G0/G1期细胞增多而G2/M期细胞减少;PCNA、波形蛋白表达降低。研究表明,IL-18基因具有抑制C6胶质瘤细胞增殖、降低其恶性程度的作用。

反义VEGF基因转染对HEP-2细胞生物学行为的影响

目的观察反义VEGF基因转染对HEP-2细胞生物学行为的影响。方法克隆人VEGF基因,将VEGF-cDNA反向克隆到真核表达载体pcDNA3,构建反义VEGF表达载体pcDNA3-VEGF(-);利用阳离子脂质体载体,稳定转染人喉癌Hep-2细胞,并通过流式细胞仪检测,观察转染细胞细胞周期的改变,在透射电镜下观察转染细胞超微结构的改变;将转染细胞注入裸鼠皮下,观察肿瘤生长情况。结果成功克隆了人VEGF基因,并构建了携带反义VEGF基因的真核表达载体pcDNA3-VEGF(-);将其稳定转染人喉癌Hep-2细胞,获得了稳定表达反义VEGF的细胞系,与正常Hep-2细胞相比,该细胞系细胞周期及超微结构均无明显改变;将转染细胞注入裸鼠皮下,与对照组相比,肿瘤的生长速度明显减缓。结论反义VEGF基因转染可以有效地抑制喉癌的生长。

TRKC基因体外转染大鼠神经干细胞的方法

目的探讨体外转染TRKC基因的神经干细胞的制备方法。方法利用自行合成的引物进行PCR反应,定向克隆构建TRKC-cDNA质粒并进行DNA测序分析,将pEGFP-C1质粒和TRKC-cDNA质粒进行酶切、重组,构建出pEGFP-C1-TRKC质粒。用脂质体将重组质粒转染到体外培养的大鼠神经干细胞中。用W estern b lot、免疫荧光和MTT法观察转染基因的表达和转基因后神经干细胞的增殖活性。结果成功构建了TRKC-cDNA质粒,DNA测序证明所获得的目的基因与公布序列的一致性为99%,所获得的重组子符合研究要求。pEGFP-C1-TRKC质粒转染到神经干细胞后,宿主细胞能高效、稳定地表达目的基因产物GFP和TRKC。在NT-3作用下转TRKC基因神经干细胞的增殖活性有明显增强。结论以质粒为载体、脂质体为介导可成功地把TRKC基因转染到神经干细胞内,转染基因表达好且具有功能。

Leptin对瞬时转染OBRb基因的C2C12细胞系PI3K活性的影响

目的:观察瘦素(leptin)对C2C12肌小管及瞬时转染OBRb基因的C2C12肌小管PI3K活性变化的影响,探讨leptin对外周组织直接作用的可能通路及其受体调控机制。方法:用脂质体介导基因转染;用马血清诱导C2C12成肌细胞分化为肌小管;OBRb mRNA表达用RT—PCR检测;leptin受体蛋白表达用Western印迹法检测;用抗JAK-2多克隆抗体免疫沉淀相关蛋白,以L-磷脂酸肌醇为反应底物,通过对掺入PI3K的32p放射活性磷屏扫描分析,检测PI3K活性变化。

nm23-H_1基因转染前后人肺癌细胞中PKC转位的研究

目的 探讨nm2 3 H1转染和蛋白激酶C(PKC)特异抑制剂CalphostinC对人高转移大细胞肺癌细胞株L9981细胞PKC信号转导通路的作用 ,以及nm2 3 H1基因对PKC激活转位的影响。方法 应用激光扫描共聚焦显微镜观察nm 2 3 H1基因转染前后和CalphostinC处理转基因细胞株L9981 nm2 3 H1前后PKC在不同的亚细胞区域的定位情况。结果 ( 1)原代细胞株L9981和空载体细胞株L9981 pLXSN中PKC α、PKC βⅡ主要位于胞核及核周 ,处于激活状态 ;转染nm 2 3 H1基因后的人肺癌细胞株L9981 nm2 3 H1中PKC α、PKC βⅡ主要位于胞浆 ,处于未激活状态。 ( 2 )CalphostinC作用后所有细胞中的PKC均主要位于胞浆中 ,处于未激活状态。结论 ( 1)nm2 3 H1基因可使L9981细胞株中PKC从胞核向胞浆转位 ,从而抑制PKC信号转导。 ( 2 )CalphostinC可使L9981、L9981 pLXSN细胞株中PKC从胞核向胞浆转位 ,从而抑制PKC信号转导。

外源性TRAIL基因转染对胶质瘤C6细胞凋亡的实验研究

目的探讨外源性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)基因对大鼠C6胶质瘤细胞的凋亡作用。方法 C6细胞在杜伯改良的Eagle培养基(DMEM),37℃,5%CO2条件下培养;质粒提取与转染;用Hoechst试剂盒检测C6细胞凋亡。结果转染重组质粒PDC315-TRAIL的C6细胞组凋亡率明显高于未转染的C6细胞组及转染空载体PDC315的C6细胞组(P<0.05)。结论外源性TRAIL基因可引起C6细胞凋亡。

种植转染VEGF_(165)基因骨髓基质细胞的脱蛋白异体骨在裸鼠体内的成骨

目的:探讨脱蛋白骨支架种植转染血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)165基因的骨髓基质细胞体内的成骨作用。方法:从狗的髂骨穿刺骨髓分离骨髓基质细胞,应用脂质体转染VEGF165基因,以RTPCR检测转染的基因表达。随机选取4周龄BALB/C裸鼠30只,随机分为3组,各组10只。实验组A为脱蛋白骨+转染pcDNA3hVEGF165基因的骨髓基质细胞;实验组B为脱蛋白骨+骨髓基质细胞;对照组C为单纯植入脱蛋白骨+DMEM。在脊柱两侧分开肌间隙,每只裸鼠植入2块脱蛋白骨材料至肌腹内。术后4、8周处死取材,经大体观察、组织形态学与免疫组化方法检查细胞-材料复合物植入后的成骨作用及VEGF表达。结果:组织学检查A、B组均有成骨,并随时间延长而新骨增多,但其中转基因的A组其成骨作用明显,并在植入4周后免疫组化可见VEGF表达呈阳性;对照组C无成骨现象。结论:转染VEGF165基因骨髓基质细胞复合脱蛋白骨在体内具有较好的成骨作用。

CⅡTA反义基因体外转染对HLA-Ⅱ类抗原表达的抑制作用的研究

目的:针对同种异体细胞移植的免疫反应主要由HLA-Ⅱ类抗原介导,而CⅡTA基因对HLA-Ⅱ分子的表达起严格且专一性的调控作用,拟通过CⅡTA的反义cDNA抑制细胞表面HLAⅡ分子的表达。方法:以RT-PCR从HLAⅡ抗原组成型表达的Raji细胞株克隆CⅡTA反义片段(arⅡ),插入腺相关病毒载体psNAV中(pAarⅡ)。将该质粒通过脂质体稳定转染Heda细胞(pAar Ⅱ H),检测其表面HLAⅡ分子表达,并以RT-PCR检测其CⅡTA、HLA-Ⅱ(DR、DP及DQ)及Ii分子的mRNA水平。结果:pAarⅡH在重组人IFN-γ诱导下,DR、DP及DQ抗原表达分别降低了79±12%、90±15%及40±8%;同时HLA-Ⅱ及Ii分子的mRNA被明显抑制。结论:提示CⅡTA反义基因片段抑制了自身组成型及诱导型表达量,并相应阻止了CⅡTA所调控的基因(HLA-Ⅱ及Ii)的表达,从而为进一步探讨免疫耐受形成及其在组织工程中的应用奠定了基础。

联合转染p21基因及反义C-Fos核酸对自体移植静脉内膜增生的影响

①目的 探讨联合转染p2 1基因及反义C Fos核酸对自体移植静脉内膜增生的影响 ,探索一种理想的预防血管再狭窄的基因疗法。②方法 选用 2 0只新西兰家兔 ,实验组 10只 ,对照组 10只 ,均行自体颈静脉、颈总动脉移植手术 ,实验组行腺病毒介导的p2 1cDNA溶液浸泡和反义C Fos寡聚核酸凝胶涂布 ;对照组仅行空载腺病毒溶液浸泡和凝胶涂布。术后 2周取出移植血管 ,分别检测移植血管内膜厚度、内膜平滑肌细胞数 (VSMC)及内膜平滑肌细胞增殖细胞抗原 (PCNA)阳性表达情况。③结果 实验组移植血管内膜厚度、管腔狭窄度、VSMC数及PCNA阳性表达情况较对照组均有明显差异 (t=2 8.30～ 38.5 2 ,P <0 .0 1)。④结论 联合转染p2 1基因及反义C Fos核酸可有效地抑制移植静脉内膜的增生 ,是一种有效防治移植静脉再狭窄的基因疗法。

CYP2C19基因多态性真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立

目的:构建细胞色素P450CYP2C19*1、*2、*3真核表达载体,并分别转染人肝癌细胞(HepG2),建立高表达目的基因的稳定转染细胞系。方法:应用化学合成法合成CYP2C19*1(野生型)序列,再以此为模板,体外定点突变PCR法构建*2、*3(突变型)。DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.l(-),经菌落PCR、酶切以及测序鉴定后,脂质体转染法转染HepG2细胞,通过G418选择培养,建立稳定转染细胞系,RT-PCR、Western Blot分别检测CYP2C19*1、*2、*3 mRNA以及蛋白的表达。结果:成功构建了pcDNA3.1(-)-CYP2C19*1、*2、*3表达质粒,并建立了相应稳定转染细胞系。进一步的RT-PCR和Western Blot检测结果表明,目的基因均得到了稳定的表达。结论:人CYP2C19*1、*2、*3稳定表达细胞系为研究创新药物或新药先导化合物临床前代谢性质的筛选和预测以及为临床潜在药物相互作用提供了有效实验平台。

不同基因转染对骨髓基质干细胞成骨活性的影响

为了优化骨组织工程种子细胞,探讨不同基因对骨髓基质干细胞(M SC s)成骨活性的影响,我们首先利用RT-PCR方法获得了全长BM P-2,VEGF 165及bFGF基因,克隆入真核表达载体pcDNA 3.0,鉴定正确后,经脂质体介导转入分离培养的大鼠骨髓基质干细胞,G 418筛选出稳定表达株。并利用RT-PCR、免疫组织化学方法证明目的基因能够在骨髓基质干细胞中得到稳定表达。M TT实验结果显示转基因后的M SC s增殖能力有不同程度的提高。细胞内碱性磷酸酶活性明显上调,BM P-2、bFGF转染组骨钙素水平升高,成骨活性增强。提示:BM P-2、bFGF基因修饰的骨髓基质干细胞作为种子细胞能够更为有效地在骨组织工程中发挥作用。

VEGF基因转染内皮前体细胞能促进血管新生

据近期研究报道,内皮前体细胞(EPC)已被用于治疗领域。研究人员在实验中将EPCs经过体外扩增后输注给下肢缺血或心肌缺血的动物模型体内,研究结果发现可成功地促进新血管的生成。但EPC功能有可能受到诸如衰老、糖尿病、高胆固醇血症、高半胱氨酸血症等因素的影响。而基因重组技术的应用则可能成为克服这些潜在问题的手段。