小鼠天然可溶性VEGF受体基因sflt-1的克隆及鉴定

可溶性血管内皮细胞生长因子受体 (sFlt 1 )与膜表面受体Flt 1竞争结合血管内皮细胞生长因子 (VEGF) ,并且与膜表面受体Flt 1及KDR形成异源二聚体 .完全阻断VEGF的生物学活性 ,除与sFlt 1的结合部位结构域有关外 ,还与整个蛋白质分子的高效分泌表达有关 .而蛋白质分子的高效分泌表达与蛋白质在细胞内高尔基体及内质网的加工密切相关 ,基因工程重组可溶性受体由于一些尚未明了的原因 ,往往不能高效表达 ,从而大大影响了其应用价值 .利用RT PCR技术从胚胎小鼠中扩增出天然可溶性VEGF受体基因sflt 1 ,克隆于pcDNA3载体中 ,在COS 7细胞中短暂表达 ;并克隆至pET42b载体中 ,经IPTG诱导后 ,可大量稳定表达与His Tag形成的融合蛋白 ,经HisNi柱纯化 ,可特异性结合VEGF .可溶性受体sFlt 1在肿瘤组织的高效表达可有效阻断新生血管的形成 ,从而为肿瘤的治疗探索一种方法 .

可溶性VEGF受体sflt-1载体的构建

目的本文以逆转录病毒作为载体将sflt-1基因结构中前3个免疫球蛋白区域的编码序列插入 ,构建成含有sflt-1的载体 ,为抑制肿瘤的血管新生提供基础。方法与结果1、sflt-1基因制备购买新鲜胎盘 ,用异硫氰酸胍提取总RNA。经RT -PCR制备sflt-1基因 ,引物设计如下 :P1 :5’ -GGAATTCCGCGCTCAC CATGGTCAGC -3’ ;P2 :5’ -TTGGATCCTACCGCTTGCCAGCTACG GTTT-3’。目的基因共1080bp,包含sflt-1前三个免疫球蛋白区域 ,两端分别加上EcoRI和BamHI位点。PCR反应设定 :94℃5min,使模板充分变性 ,94℃1min ,55℃1min ,72℃1min30s ,共30个循环 ,72℃10min。PCR产物有目的片断和600bp的杂带 ,经调整复性温度不能去除 ,将含目的片断的凝胶条带切下并提取DNA。2、sflt—1基因片断的克隆与测序用 pUC -T-vector将目标DNA接入质粒 ,DNA片断A -tailing:2μl10Xbuffer,1UTaq酶 ,0 .5μl10mMdNTP ,纯化的DNA片断 ,共组成201反应体系。72℃15min。纯化DNA连接反应 ,1μlpUC_mT ,1μl2Xbuffer,1150 %PEG8000 ,纯化的DNA产物70g,0 .5μlT4DNA连接酶 ,加适量水组成10μl反应体系 ,20℃温育8h ,22℃温育8h ,连接反应产物转化感受态细菌 ,置于含50g/m1青霉素的LB平板 ,37℃过夜 ,挑取克隆在LB中扩增 ,提取质粒后用EcoRI和BamHI酶 切 ,

可溶性VEGF受体FLT-1克隆、表达及其对血管生成的抑制作用

目的 :克隆VEGF受体sFLT 1片段 1 3区 ,并使之在原核中进行表达以探讨其对内皮细胞增殖和血管生成方面的抑制作用。方法 :提取脐静脉血管内皮细胞总RNA ,克隆sFLT 1基因 1 3区 ,并使之在QIA表达系统进行表达 ;Ni2 + Sepharose6B亲和层析纯化、复性。应用MTT和鸡胚绒毛尿囊膜血管生成模型 ,探讨重组蛋白对血管生成的抑制作用。结果 :该表达系统能表达sFLT 1基因片段 ,表达量低。纯化后 ,经复性 ,sFLT 1具有与VEGF特异结合功能 ,1μg重组sFLT 1蛋白能抑制 10ngVEGF诱导的脐静脉内皮细胞增殖和 2 0ngVEGF诱导的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成。结论 :sFLT 1基因片段能在QIA表达系统中得到表达 ,复性后重组蛋白具有与VEGF结合和拮抗VEGF生物学活性的功能。

血清可溶性血管内皮生长因子受体-1在AECOPD患者合并肺炎风险评估和预后判断中的价值

目的分析可溶性血管内皮生长因子受体-1(sFlt-1)在慢性阻塞性肺疾病急性加重期(AECOPD)是否合并社区获得性肺炎(CAP)患者中的差异,并评估其判断预后的潜力。方法对2016年1月至2017年10月就诊于浙江省立同德医院及温州市中心医院连续性符合条件的CAP患者(n=48)、CAP+AECOPD患者(n=20)或AECOPD(n=34)患者进行了前瞻性队列研究。通过常规自动化测试C-反应蛋白(CRP)、hs肌钙蛋白T、NTproBNP、降钙素原和血液计数,并采用电化学发光免疫法分析sFlt-1水平。结果不同诊断组患者的炎症指标、sFlt-1、血红蛋白、纤维蛋白原有明显差异(P<0.05)。CAP+AECOPD组的CRP、sFlt-1、降钙素原、hs肌钙蛋白T、NT-proBNP、纤维蛋白原较AECOPD组显著升高(P<0.05),而血红蛋白较AECOPD组显著下降(P<0.05)。CRP(r=0.504,P=0.005)、sFlt-1(r=0.384,P=0.009)和降钙素原(r=0.307,P=0.042)与住院时间呈显著正相关。与入院时相比,sFlt-1水平在出院后再入院的患者中表现更高[(27.91±5.82)ng/Lvs.(16.26±4.33)ng/L,P=0.022],并且在30d内死亡患者中sFlt-1水平[(30.46±5.74)ng/L]更高。sFlt-1水平高于19.451ng/L区分AECOPD和CAP+AECOPD的阳性预测值为66%,阴性预测值为80%,灵敏度为66%,特异性为80%,ROC曲线下面积为0.78。结论血清sFlt-1水平能快速区分AECOPD患者是否合并CAP,而且可以初步预测住院时间和短期临床预后。

NB-UVB治疗寻常性银屑病量效关系及对血清TNF-α1受体和VEGF的影响

目的探讨窄谱中波紫外线(NB-UVB)治疗寻常性银屑病的量效关系及对患者血清TNF-α1受体和VEGF含量的影响。方法将69例寻常性银屑病患者随机分为A组(70%MED起始量+20%增量组)、B组(0.4J/cm2传统起始量+固定增量组)和C组(非照射组)三组,每组各23例,A,B组均为隔日NB-UVB照射1次,共治疗8周,同时选取12例志愿者作为健康对照组。采用酶联免疫吸附技术检测上述各组患者治疗前、治疗4周、8周后TNF-α1受体及VEGF含量变化情况;同时对各组患者进行PASI评分。结果 A,B,C三组患者经治疗4周后有效率分别为78.26%,26.09%,8.70%;8周后有效率为95.65%,69.57%,13.05%,A组疗效均明显优于B组和C组(P<0.01)。A,B两组治疗4,8周后VEGF水平均较治疗前显著降低(P<0.05),与B组比较,A组下降幅度更为明显(P<0.01)。A组的TNF-α1受体水平于治疗4,8周后均较治疗前明显降低(P<0.05);而B组直至治疗8周后才开始降低,与A组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论根据每个患者MED值确定NB-UVB的起始剂量后采用渐进性增量法治疗寻常性银屑病,其累积剂量上升快、总量高、可以更快控制病情,降低PASI评分;其可能是通过降低VEGF和可溶性TNF-α1受体水平,甚至达到正常人水平来实现的。

补肾安胎冲剂对复发性流产患者血清血管内皮生长因子及其可溶性受体-1的影响

目的探讨补肾安胎冲剂治疗复发性流产(recurrent spontaneous abortion,RSA)的机制。方法采用酶联免疫吸附法检测30例RSA患者治疗前后及30例正常早孕妇女血清血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor,VEGF)及其受体———可溶性fms样酪氨酸激酶-1(soluble fms-like tyrosine kinase-1,sFlt-1)的水平。结果治疗组妊娠成功率为80.0%;与对照组比较,治疗组治疗前血清VEGF显著降低(P<0.01),sFlt-1显著增高(P<0.01);治疗组治疗后与治疗前比较,VEGF显著升高(P<0.01),sFlt-1显著降低(P<0.01);保胎治疗无效者与保胎治疗成功者比较,血清VEGF水平显著降低(P<0.01),血清sFlt-1水平显著增高(P<0.05)。结论补肾安胎冲剂治疗RSA的机制可能与提高血清VEGF水平,降低血清sFlt-1水平,从而促进胎盘绒毛血管的形成有关。

可溶性血管内皮生长因子受体-1在子痫前期胎盘及在外周血的研究

目的研究可溶性血管内皮生长因子受体-1(sFlt-1) mRNA在正常妊娠和子痫前期胎盘中的表达差异及相应的母体外周血中sFlt-1水平的变化。方法选取15例子痫前期孕妇(子痫前期组)和14例孕周与之相匹配的血压正常妊娠孕妇(对照组),用ELISA方法测定其外周血中sFlt-1的水平;并应用实时荧光定量PCR测定两组胎盘组织中sFlt-1 mRNA水平。结果外周血中sFlt-1的水平子痫前期组明显高于对照组,分别为(16.9±8.32)μg/L、(5.48±2.09)μg/L,两者差异有显著性(P<0.05)。sFlt-1 mRNA在两组胎盘中均有表达,在子痫前期组的表达明显高于对照组的表达分别为(4.11±4.09)、(1.69±1.61),两者差异有显著性(P<0.05)。子痫前期组血清sFlt-1水平与24h尿蛋白定量呈明显正相关(r=0.741,P<0.05)。结论sFlt-1 mRNA在子痫前期组孕妇的外周血中及胎盘组织表达升高,可能与子痫前期的病因及病理生理有关。

人可溶性血管内皮细胞生长因子受体Flt-1基因在链霉菌中的克隆表达

应用RT PCR技术 ,从人脐静脉内皮细胞中扩增出编码人可溶性血管内皮细胞生长因子 (VEGF)受体Flt 1胞外区前四个结构域的基因片段 ,亚克隆至pUCl8质粒进行测序 ,将目的基因片段连接至链霉菌表达载体pSGLgpp ,获得重组质粒pSGLgpp F ,将其转化至Streptomy ceslividansTK2 4 ,获得基因工程菌株Sreptomyceslividans (pSGLgpp F) ,对其培养上清液进行SDS PAGE及Westernblot分析 ,结果显示 ,在 6 3 6kD处有特异性条带出现 ,表明sFLT 1在链霉菌中获得了成功表达 ,受体配基结合实验显示表达产物与VEGF可特异性结合 。

可溶性血管内皮生长因子受体1在IgAN的研究进展

可溶性血管内皮生长因子受体1(soluble fms-like tyrosine kinase 1,sFlt-1)是已证实的内皮细胞损伤的分子标志物.sFlt-1在循环中结合VEGF(血管内皮生长因子)而调节其功能,拮抗VEGF的营养功能而导致内皮细胞损伤.有研究发现在慢性肾脏疾病(CKD)患者中sFlt-1有明显升高,过量的sFlt-1与CKD内皮功能障碍有关.而IgAN是我国最常见的CKD,目前国内外缺乏关于sFlt-1在IgAN中的相关研究.sFlt-1与IgAN临床病理之间相关性的研究是一个全新的研究方向.研究sFlt-1与CKD特别是发病率很高的IgAN的相关性并应用其研究成果,对IgAN的诊断、治疗和判断预后是一个新的思路.

孕中晚期血清PIGF、sFlt-1及sEng预测早期子痫的诊断价值

目的探讨血清胎盘生长因子(PIGF)、可溶性血管生长因子受体-1(sFlt-1)、可溶性内皮因子(sEng)及其比值sFlt-1/PIGF、sEng/PIGF在预测子痫前期发病中的诊断价值。方法该研究采用前瞻性病例对照研究,纳入孕20~40孕周健康对照629例(健康对照组),子痫前期(PE)患者188例(PE组),妊娠期高血压(GH)患者57例(GH组)。检测各组血清PIGF、sFlt-1、sEng水平,比较各指标之间的差异,评价其在预测子痫前期发病的诊断价值。结果血清PIGF、sFlt-1、sEng、sFlt-1/PIGF、sEng/PIGF水平在PE组与健康对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),预测PE发病的受试者工作特征(ROC)曲线下面积分别为:0.741、0.823、0.813、0.872、0.888;预测早发型PE的ROC曲线下面积则分别为:0.903、0.909、0.896、0.914、0.944。结论孕中晚期孕母血清PIGF、sFlt-1、sEng、sFlt-1/PIGF、sEng/PIGF在预测PE的发病,特别是早发型PE的发病具有较高的诊断价值。

胎儿生长受限大鼠胎盘sFLT-1、PLGF的表达及川芎嗪的干预作用

目的:观察川芎嗪干预下大鼠胎儿生长受限(FGR)胎盘中可溶性血管内皮生长因子受体-1(SFLT-1)、胎盘生长因子(PLGF)的表达及其意义。方法:15只SD大鼠分为川芎嗪(TMP)组(FGR治疗组)、FGR非治疗组、正常对照组,FGR治疗组给予高粱酒灌胃,烟熏3次,每次15min,第13天起每天清晨烟熏灌胃后给予TMP 8mg/kg腹腔注射;FGR非治疗组从妊娠第7天起,每日给予高粱酒灌胃,烟熏3次,每次15min;正常对照组从妊娠第7天起,每天9点9mL/kg生理盐水灌胃,每天3次烟熏箱关15min但不烟熏。3组大鼠均于妊娠第20天解剖,比较各组大鼠胎盘PLGF、sFLt-1的表达。结果:FGR治疗组与FGR非治疗组、正常对照组SFLT-1差异无统计学意义(P>0.05);FGR治疗组与FGR非治疗组、正常对照组PLGF差异有统计学意义(P<0.01)。结论:FGR大鼠胎盘SFLT-1升高、PLGF下降,SFLT-1、PLGF可考虑作为胎儿生长受限的筛查指标;经川芎嗪处理后的大鼠胎盘SFLT-1无显著差异,PLGF升高,川芎嗪可考虑作为胎儿生长受限的治疗药物。

川芎嗪干预胎儿生长受限对胎盘sFlt-1、PLGF的影响

目的:探讨川芎嗪干预胎儿生长受限对胎盘可溶性血管内皮生长因子受体-1(sFlt-1)、胎盘生长因子(PLGF)的影响。方法:选择在我院妇产科住院的胎儿生长受限患者60例,随机分为两组,川芎嗪干预组(A组)30例,营养支持组(B组)30例,同期正常孕妇50例作为对照组(C组),比较各组sFlt-1、PLGF表达水平及胎儿生长发育参数,包括胎儿头围(HC)、腹围(AC)、股骨长(FL)、胎头双顶径(BPD),估计胎儿体重(EFW)。结果:A组sFlt-1、PLGF表达水平与C组无差异(P>0.05);B组sFlt-1、PLGF表达水平与C组有显著差异(P<0.05),治疗前A、B组HC、AC、FL、BPD、EFW均明显小于C组,治疗后A组HC、AC、FL、BPD、EFW均明显高于治疗前(P<0.05)。结论:应用川芎嗪治疗胎儿生长受限能够显著改善胎盘sFlt-1、PLGF水平,是安全经济有效的。

血清PlGF和sFlt-1评估慢性心力衰竭患者心功能分级的临床价值研究

目的探讨血清胎盘生长因子(PlGF)及可溶性fms样酪氨酸激酶受体1(sFlt-1)对于评估慢性心力衰竭(CHF)患者心功能分级的价值以及影响因素。方法选择2018年1月至2019年1月间于沧州市中心医院老年内科确诊并接受治疗的缺血性心力衰竭患者100例,另外选择60例健康志愿者作为健康对照组,比较两组患者血清PlGF和sFlt-1水平的差异。另外分析血清PlGF和sFlt-1水平以及PlGF/sFlt-1比值与CHF患者NYHA心功能分级、血浆N末端脑钠肽前体(NT-proBNP)含量、左室射血分数(LVEF)的相关性。并采用受试者工作特征(ROC)曲线和多因素Logistic回归模型分析血清PlGF和sFlt-1水平、PlGF/sFlt-1比值的诊断价值。结果CHF患者血清PlGF、sFlt-1基线水平明显高于健康对照组受试者,且PlGF/sFlt-1比值低于健康对照组受试者(P<0.05)。经多因素Logistic回归分析,校正各项混杂因素后,PlGF是CHF发生的独立危险因素,且PlGF/sFlt-2是CHF发生的独立保护因素(P<0.05)。与Ⅱ级CHF患者相比,Ⅲ~Ⅳ级CHF患者血清PlGF和sFlt-1水平升高,而PlGF/sFlt-1比值则降低(P<0.05)。经Pearson相关性分析,CHF患者血清PlGF水平和PlGF/sFlt-2比值与NT-proBNP、LVEF都具有显著的相关性(P<0.05)。PlGF+sFlt-1+PlGF/sFlt-1比值诊断Ⅲ~Ⅳ级CHF的ROC曲线下的面积为0.811(95%CI:0.731~0.876,P<0.001)。结论CHF患者血清PlGF和sFlt-1水平较健康对照组升高,而PlGF/sFlt-1比值则降低,对于Ⅲ~Ⅳ级CHF具有良好地诊断效能。

不同氧浓度对原代培养人早孕绒毛细胞滋养细胞血管内皮生长因子及其可溶性受体表达的影响

目的:探讨原代培养人早孕绒毛细胞滋养层细胞(CT)在缺氧时血管内皮生长因子(VEGF)和可溶性血管内皮生长因子受体-1(sFlt-1)的表达。方法:将经胰蛋白酶/DNA酶Ⅰ联合消化通过Percoll分离纯化得到的细胞滋养层细胞进行原代培养。采用ELISA法测定正常氧浓度(20%O2,A组)、低氧浓度Ⅰ组(8%O2,B组)和Ⅱ组(2%O2,C组)及低氧复氧组(2%O2/20%O2,D组)培养的不同时段细胞上清液中VEGF和sFlt-1蛋白的表达。结果:B组、C组于培养72h、96h、120h、144h时间点测得VEGF、sFlt-1的浓度明显高于A组(P<0.01);D组于培养96h、120h、144h后测得VEGF、sFlt-1的浓度较72h低,且分别与A组同期相比无明显差异(P>0.05)。结论:细胞滋养层细胞在低氧条件下VEGF、sFlt-1分泌增加,低氧复氧后VEGF和sFlt-1表达均恢复正常。

胎儿生长受限患者sFlt-1、PLGF的表达及其意义

目的:观察胎儿生长受限患者血清可溶性血管内皮生长因子受体-1(sFlt-1)、胎盘生长因子(PL-GF)的表达及其意义。方法:30例胎儿生长受限患者作为实验组,同期住院的30例正常孕妇作为对照组,住院当天留取两组孕妇的血清标本,用ELISA法检测血清中sFlt-1、PLGF的水平,并进行比较。结果:实验组、对照组的PLGF水平分别为(1 462.39±364.51)、(2 685.05±322.61)pg/mL,sFlt-1水平分别为(9 509.67±1 406.91)、(4 103.42±661.82)pg/mL,两组PLGF、sFlt-1水平差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:FGR时孕妇血清sFlt-1升高、PLGF下降,sFlt-1、PLGF可考虑作为胎儿生长受限的筛查指标。

早孕期血清sFlt-1、PIGF水平及sFlt-1/PIGF比值与子痫前期的相关性研究

目的探讨早孕期血清可溶性血管内皮生长因子受体-1(sFlt-1)和胎盘生长因子(PIGF)水平以及sFlt-1/PIGF比值与子痫前期的相关性。方法采用病例对照方法,分别检测妊娠期高血压组(n=26)、子痫前期组(n=35)、重度子痫前期组(n=32)和对照组(n=41)孕妇血清标本sFlt-1和PIGF水平,并比较其浓度分布及sFlt-1/PIGF比值情况。用受试者工作特征(ROC)曲线确定最佳临界值、曲线下面积(AUC),对sFlt-1、PIGF水平及sFlt-1/PIGF比值的筛查效能进行评价。结果妊娠期高血压组、子痫前期组、重度子痫前期组sFlt-1水平高于对照组(P<0.05);妊娠期高血压组、子痫前期组、重度子痫前期组PIGF水平低于对照组(P<0.05);妊娠期高血压组、子痫前期组、重度子痫前期组sFlt-1/PIGF比值高于对照组(P<0.05)。妊娠期高血压组早孕血清sFlt-1、PIGF和sFlt-1/PIGF比值的AUC分别为0.743、0.804和0.787,三者对应的灵敏度分别为92.30%、70.70%和96.20%;子痫前期组早孕血清sFlt-1、PIGF和sFlt-1/PIGF比值的AUC分别为0.696、0.761和0.740,其对应的灵敏度分别为70.60%、65.90%和79.40%;重度子痫前期组早孕血清sFlt-1、PIGF和sFlt-1/PIGF比值的AUC分别为0.703、0.774和0.762,对应的灵敏度分别为50%、65.90%和84.40%。结论早孕期妇女血清高水平sFlt-1、低水平PIGF和高sFlt-1/PIGF比值是妊娠期高血压和子痫前期的危险因素,采用sFlt-1/PIGF比值筛查妊娠期高血压和子痫前期的效率优于单用sFlt-1、PIGF的筛查效率。

血清sFlt-1及25羟基维生素D与复发性流产相关性分析

目的 观察可溶性血管内皮生长因子受体（sFlt-1）和25羟基维生素D在正常早孕及复发性流产患者妊娠后外周血中水平,探讨血清sFlt-1及25羟基维生素D与复发性流产的相关性.方法 采用酶联免疫吸附试验法测定17例正常早孕及22例复发性流产患者妊娠后血清中sFlt-1及25羟基维生素D的水平.结果 复发流产患者妊娠组其血清sFlt-1高于正常早孕组,而25羟基维生素D水平低于正常早孕组,差异有统计学意义（P〈0.05）.结论 血清sFlt-1及25羟基维生素D与复发性流产可能具有相关性.