VEGF启动子介导双自杀基因重组腺病毒对LoVo细胞的体外杀伤作用

目的探讨VEGF启动子驱动的CD/TK双自杀基因重组腺病毒(Ad-VEGFp-CDglyTK)对大肠癌LoVo细胞的体外杀伤作用。方法分别用重组腺病毒Ad-VEGFp-CDglyTK、Ad-CMV-CD、Ad-CMV-TK、Ad-CMV-CDglyTK转染大肠癌LoVo细胞,给予前药5-FC、GCV,测定LoVo细胞的集落形成、细胞存活率及该治疗系统的旁观者效应。结果与Ad-CMV-CD、Ad-CMV-TK相比,Ad-VEGFp-CDglyTK系统对LoVo细胞的集落形成、细胞生长均具有更强抑制作用,并可见较明显的旁观者效应。而与CMV启动子的双自杀基因相比,其作用无显著性差异。结论VEGF启动子驱动的双自杀基因治疗系统对大肠癌LoVo细胞有确切的杀伤作用,其作用强度与强启动子CMV驱动的双自杀基因治疗系统相似。

含VEGF启动子的报告基因的构建及雌激素受体对其活性的影响

目的:构建含血管内皮生长因子(VEGF)基因启动子的荧光素酶报告基因载体,并检测其在雌激素受体作用下的转录活性。方法:以乳腺癌细胞系MCF-7基因组为模板,扩增VEGF启动子片段,克隆到荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中。用脂质体介导的基因瞬时转染法,将重组正确的报告基因载体转染293T细胞,检测重组质粒中荧光素酶报告基因的表达。结果:酶切鉴定和DNA序列分析表明构建了正确的pGL3-basic-VEGF报告基因载体;转录活性实验表明构建的报告基因载体具有启动子活性,雌激素受体α(ERα)能以剂量依赖的方式升高VEGF启动子调控下的报告基因的转录。结论:克隆了VEGF启动子,为ERα共调节子的功能研究奠定了基础。

腺病毒介导的VEGF启动子—胸苷激酶系统对骨肉瘤细胞的杀伤试验

目的 探讨腺病毒介导的VEGF启动子调控的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 (HSV tk)系统 (AdVEGF tk)对体外培养的骨肉瘤细胞的选择性杀伤作用。方法 采用 2种重组腺病毒载体AdVEGF tk和AdCMV tk(CMV启动子调控tk基因表达 )体外感染低表达VEGF的成骨细胞系MC3T3 E1和高表达VEGF的骨肉瘤细胞系LM 8,并给予不同浓度的丙氧鸟苷 (GCV)处理 ,用MTT法检测感染细胞的增殖情况。结果 未感染病毒或感染空病毒的MC3T3 E1细胞和LM8细胞对GCV不敏感 ,感染AdCMV tk的MC3T3 E1细胞和LM 8细胞对GCV敏感。与感染空病毒的MC3T3 E1细胞相比 ,感染AdVEGF tk的MC3T3 E1细胞对GCV的敏感性轻度增加 ,用 5 0 μg/mlGCV处理时 ,30 %MC3T3 E1细胞被杀死 ;感染AdVEGF tk的LM8细胞对GCV的敏感性明显增加 ,用 5 0 μg/mlGCV处理时 ,95 %LM 8细胞被杀死 ,产生的细胞毒活性表现为剂量依赖性。结论 腺病毒介导的VEGF启动子 tk/GCV系统对高表达VEGF的骨肉瘤细胞具有杀伤作用。

VEGF启动子活性的测定

目的构建含有VEGF基因的不同片段启动子的荧光素酶报告基因载体,并检测VEGF启动子不同片段的活性。方法用PCR扩增出VEGF启动子的不同片段,插入到荧光素酶报告基因载体pGL4-basic中,确定所扩增的DNA序列后,将其转染至293T细胞中,检测其不同片段的活性。结果测序结果表明,扩增的不同片段的VEGF启动子序列正确;荧光素酶活性实验表明,VEGF启动子+72～-128 bp至+72～-528 bp片段具有较高的活性。结论构建了VEGF启动子5'端缺失不同片段突变体报告基因表达载体,为VEGF转录因子的筛选及功能研究提供了重要基础。

VEGFP-CDglyTK系统诱导肝癌细胞凋亡的实验研究

目的探讨腺病毒介导血管内皮生长因子(VEGF)启动子驱动的CD/TK双自杀基因体系(Ad-VEGFP-CDglyTK)对肝癌细胞HepG2的体外杀伤作用。方法用重组腺病毒Ad-VEGFP-CDglyTK体外感染表达VEGF的HepG2细胞,荧光显微镜观察其感染效率,然后给予前药更昔洛韦(GCV)和5-氟胞嘧啶(5-FC),在光镜、透射电镜下观察,用流式细胞术等方法观察细胞凋亡、细胞周期及细胞内DNA含量的变化。结果腺病毒对HepG2细胞的感染率随病毒滴度的增高而递增。在感染复数为100时,前药GCV和5-FC在一定范围(GCV+5-FC分别为:1mg/L+20mg/L,10mg/L+40mg/L,100mg/L+60mg/L)内呈剂量依赖性地诱导HepG2细胞凋亡;中浓度下(GCV:10mg/L,5-FC:40mg/L)作用细胞72h,透射电镜下可见HepG2细胞发生典型凋亡改变:空泡形成,染色质浓缩、沿核膜排列,甚至出现核碎裂现象。流式细胞仪测定见用药组出现典型的凋亡峰;随着药物浓度的增加,凋亡细胞所占的比例逐渐增加,实验组凋亡细胞数与对照组比较有显著性差异(P<0.01);细胞周期分析显示前药能明显抑制HepG2/CD-TK细胞的增殖,主要作用在细胞G2-M期。结论VEGF启动子可调控双自杀基因系统选择性杀伤表达VEGF的HepG2细胞,其机制与诱导细胞凋亡有关。

Ad-VEGFP-CD/TK系统诱导胃癌细胞凋亡的实验研究

目的探讨腺病毒介导的VEGF启动子驱动的CD/TK双自杀基因体系(Ad-VEGFP-CD/TK)对胃癌细胞SGC-7901的体外杀伤作用。方法用重组腺病毒Ad-VEGFP-CD/TK体外感染表达VEGF的SGC-7901细胞,荧光显微镜观察其感染效率,然后给予前药GCV和5-FC,用光镜、透射电镜观察及流式细胞术等方法观察细胞凋亡、细胞周期、细胞内DNA含量及钙离子浓度的变化。结果腺病毒的感染率随病毒滴度的增高而递增,在感染复数为100时,前药GCV和5-FC在一定浓度搭配范围内呈剂量和时间依赖性地诱导SGC-7901细胞凋亡,电镜下可见细胞凋亡的典型改变。用流式细胞仪测定用药组出现典型的凋亡峰;细胞周期分析显示治疗后细胞G0-G1期比率增多,G2-M及S期细胞减少;此外,前药还可以引起细胞内Ca2+浓度持续增加。结论VEGF启动子可调控双自杀基因系统选择性诱导表达VEGF的SGC-7901细胞凋亡,其机制与细胞内钙离子浓度升高有关。

Ad-VEGFP-CD/TK系统抑制乳腺癌细胞增殖的体内外实验研究

目的探讨腺病毒介导VEGF启动子驱动的CD/TK双自杀基因体系(Ad-VEGFP-CD/TK)对乳腺癌细胞MCF-7的体内外靶向杀伤作用。方法用重组腺病毒Ad-VEGFP-CD/TK体外感染表达VEGF的MCF-7细胞和不表达VEGF的原代培养的乳腺上皮细胞,荧光显微镜观察其感染率,然后给予前药GCV和5-FC,用MTT法观察该体系对细胞生长增殖的影响及其旁观者效应;用流式细胞术观察细胞周期及细胞内DNA含量的变化。建立MCF-7裸鼠皮下移植瘤模型,瘤内注射Ad-VEGFP-CD/TK,腹腔注射前药14d,观察肿瘤生长抑制效应。结果腺病毒对两种细胞的感染率相似。MTT法检测显示MCF-7细胞对前药具有较高的敏感性,而乳腺上皮细胞对前药不敏感,且观察到该体系对MCF-7细胞明显的旁观者效应。在感染复数为100时,用流式细胞仪测定用药组出现典型的凋亡峰;细胞周期分析显示治疗后细胞G0-G1期比率增多,G2-M及S期细胞减少。在MCF-7裸鼠移植瘤模型中,该双自杀基因系统能够显著抑制肿瘤的生长。结论VEGF启动子可调控双自杀基因体系选择性杀伤人乳腺癌细胞MCF-7并诱导细胞凋亡,并可显著抑制人乳腺癌裸鼠移植瘤的生长。

腺病毒介导的双自杀基因系统对乳腺癌细胞的杀伤作用

目的探讨腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶(CD)和胸苷激酶(TK)融合双自杀基因系统对乳腺癌治疗作用。方法用重组VEGFP-CD/TK-GFP基因的腺病毒体外感染表达VEGF的乳腺癌MCF-7细胞和对照组不表达VEGF的乳腺上皮细胞,荧光显微镜观察其感染效率,以RT-PCR检测受感染细胞CD/TK的表达,然后给予前药环氧鸟苷(GCV)和/或5-氟胞嘧啶(5-FC),用MTT法观察该体系对细胞生长增殖的影响;用流式细胞术观察细胞周期变化。建立MCF-7裸鼠皮下移植瘤模型,采用瘤内注射腺病毒载体联合腹腔内注射前药GCV和/或5-FC治疗后,观察肿瘤生长情况。结果腺病毒对两种细胞的感染率相似,其感染率随腺病毒滴度的增高而递增。RT-PCR检测发现转染Ad-VEGFP-CD/TK的MCF-7细胞有目的基因的表达,而乳腺上皮细胞无表达。MTT法检测显示表达VEGF的MCF-7细胞对前药具有较高的敏感性,而不表达VEGF的乳腺上皮细胞对前药不敏感,CD/TK融合基因对MCF-7的疗效优于任一单自杀基因(P<0.01)。在感染复数为100时,用流式细胞仪分析细胞周期显示治疗组细胞G0-G1期比率增多,S期细胞减少。在MCF-7裸鼠移植瘤模型中,该双自杀基因系统能够显著抑制肿瘤的生长,其疗效优于任一单自杀基因(P<0.01)。结论腺病毒介导VEGF启动子驱动的CD/TK融合双自杀基因联合GCV和5-FC能有效治疗乳腺癌,其效果优于单自杀基因系统。

骨骼

041664 腺病毒介导的VEGF启动子—胸苷激酶系统对骨肉瘤细胞的杀伤试验/周正明…∥肿瘤.-2004,24(1).-53～55 采用2种重组腺病毒载体AdVEGF-tk和AdCMV-tk体外感染低表达和高表达VEGF的成骨细胞系MC3T3-E_1、LM8,并予不同浓度的GCV处理,以MTT法检测感染细胞的增殖情况。结果:未感染或感染病毒的MC3T3-E_1、LM8细胞对GCV不敏感,而感染AdCMV-tk的MC3T3-E_1、LM8细胞对GCV敏感。感染AdVEGF-tk的MC3T3-E_1细胞对GCV的敏感性轻度增加,以50ug/ml GCV处理时。

双自杀基因重组腺病毒对胰腺癌细胞SW1990的体外杀伤作用

目的研究腺病毒介导的血管内皮生长因子（VEGF）启动子驱动胞嘧啶脱氨酶（CD）／胸苷激酶（TK）融合基因系统（Ad—VEGFP—CDTK）对胰腺癌细胞SW1990增殖的影响。方法重组腺病毒体外感染表达VEGF的SW1990细胞株，用空腺病毒做对照，观察其感染效率并以RT-PCR、Western blot方法检测转基因细胞CDTK的表达，MTY法观察该体系对SW1990细胞生长增殖的影响及其旁观者效应；电镜观察细胞的病变；流式细胞仪检测细胞周期的变化和DNA含量的变化；分光光度法检测细胞内caspase-3活性。结果两种腺病毒对细胞株的感染率相似。RT-PCR和Western blot检测发现转染Ad—VEGFP-CDTK的细胞有目的基因和蛋白的表达。MTY法检测显示前药呈剂量依赖性抑制SW1990生长，且观察到该体系明显的旁观者效应。电镜下可见SW1990有凋亡改变。用流式细胞仪测定用药组出现典型的凋亡峰；细胞周期分析显示治疗后细胞G0-G1期比率增多，G2-M及S期细胞减少。随着前药浓度的升高转基因细胞内caspase-3活性逐渐升高。结论VEGF启动子可调控双自杀基因体系抑制胰腺癌细胞SW1990增殖，并且诱导胰腺癌细胞凋亡。

携带靶向性可调控自杀基因的重组相关腺病毒载体的构建及其活性检测

目的:构建携带受Tet-On以及VEGF启动子双调控自杀基因HSVtk的重组腺相关病毒载体,研究其在乳腺癌细胞MCF-7中的可调控表达。方法:用PCR方法扩增VEGF启动子,将其插入pAAV/TRE/HSVtk/Tet-On中形成重组载体pAAV/VEGF/TRE/HSVtk/Tet-On质粒。进行病毒包装后得到了rAAV/VEGF/TRE/HSVtk/Tet-On重组腺相关病毒。用重组腺相关病毒感染乳腺癌细胞株MCF-7和正常乳腺HBL-100细胞,用MTT法及RT-PCR检测在Dox诱导下,GCV对rAAV感染的MCF-7细胞和HBL-100细胞的杀伤作用以及HSVtk基因在MCF-7细胞内的表达情况。结果:在rAAV+Dox+GCV组,GCV对rAAV感染的MCF-7细胞的杀伤作用明显高于rAAV+Dox组,rAAV+Dox组以及HBL-100组,并且RT-PCR结果显示经Dox诱导HSVtk表达较明显。结论:成功构建了携带双调控自杀基因的重组腺相关病毒载体,该病毒载体能有效的感染乳腺癌细胞MCF-7,并能联合GCV治疗,抑制肿瘤细胞生长,而且具有靶向性。

携带双调控自杀基因的重组腺相关病毒载体的构建及初步应用

目的:为构建携带受Tet-On以及VEGF启动子调控自杀基因的重组腺相关病毒载体。方法:用PCR方法扩增VEGF启动子,将其插入pAAV/TRE/HSVtk/Tet-On,形成重组载体pAAV/VEGF/ TRE/HSVtk/Tet-On质粒。进行病毒包装后得到了AAV/VEGF/TRE/HSVtk/Tet-On重组腺相关病毒。用重组腺相关病毒感染乳腺癌细胞株MCF-7和正常乳腺HBL-100细胞,用MTT法及RT-PCR检测在Dox诱导下,GCV对rAAV感染的MCF-7细胞和HBL-100细胞的杀伤作用以及HSVtk基因在MCF-7细胞内的表达情况。结果:在rAAV+Dox+GCV组,GCV对rAAV感染的MCF-7细胞的杀伤作用明显高于rAAV+Dox组,rAAV+Dox组以及HBL-100组,并且RT-PCR结果显示经Dox诱导HSVtk表达较明显。结论:成功构建了携带双调控自杀基因的重组腺相关病毒载体,该病毒载体能有效的感染乳腺癌细胞MCF-7,并能联合GCV治疗,抑制肿瘤细胞生长,而且具有靶向性。