Vero细胞微载体悬浮培养制备人用狂犬病疫苗的研究

将“北京”及“CTN”两株中国分离的狂犬病病毒毒株适应于Vero细胞,病毒滴度可达10^(7.5)LD_(50)/ml。应用Veto细胞微载体反应器系统培养病毒,经丙内酯灭活,超滤浓缩制备的疫苗,其效力试验(NIH法)结果优于现行原代地鼠肾细胞培养疫苗。

流感病毒在Vero细胞上的适应性

目的研究WHO指定流感疫苗生产用毒株在Vero细胞上的适应性,为用Vero细胞制备流感疫苗奠定基础。方法优化不同培养基、胰酶浓度、pH值等培养病毒的条件及收毒时间,将流感疫苗生产用毒株在Vero细胞上连续传代,并进行血凝效价检测及RT-PCR分析。结果在病毒维持液为F12+DMEM、pH为7.5、胰酶含量为1.5μg/ml、培养3 d收获病毒时,可获得较高的病毒血凝效价,连续传4代,病毒血凝效价降为0,RT-PCR检测结果为阴性。结论WHO推荐的流感疫苗生产用毒株在Vero细胞上连续传代,病毒血凝效价逐渐降低。

狂犬病病毒Vero细胞适应株的建立及其应用于疫苗生产的可行性探讨

将狂犬病病毒７ａＧ固定毒适应于Ｖｅｒｏ细胞，建立了稳定的ＶＲＧ适应株。病毒滴度可达７．６９ｌｏｇＬＤ５０／ｍｌ，病毒最适增殖时间５—７天，最适种毒比例１：１０￣３。应用转瓶培养Ｖｅｒｏ细胞增殖病毒，收获病毒液经β—丙内脂灭活，超离浓缩制备疫苗，效力试验结果（ＮＩＨ法）较原制疫苗成倍增高，且都大于２．５ＩＵ／２ｍｌ，表明ＶＲＧ适应株可应用于制备Ｖｅｒｏ细胞狂犬病疫苗。

狂犬病毒CTN-1株在Vero细胞上的适应传代研究

本文报导了用我国狂犬病毒固定毒人二倍体细胞适应株（ＣＴＮ－１）进行Ｖｅｒｏ细胞适应传代研究。通过连续传代培养，滴度可达８．０ｌｏｇＬＤ_（５０）ｍｌ，达到了ＷＨＯ规定的不需浓缩的标准。病毒用０．０１ＭＯＩ感染细胞其产量与１Ｍｏｌ感染量相仿。病毒增殖高峰在４－５天，维持达１５天无明显下降，且可连续收获４－５次。因此，该毒种符合ＷＨＯ提出的疫苗生产毒种要求，可用于狂犬病疫苗生产。

狂犬病固定毒aG株在Vero细胞上的传代适应研究

目的 为研制安全 ,有效和使用方便的Vero细胞狂犬疫苗提供基础资料。 方法 对狂犬病固定毒 3aG株在Vero细胞上的传代适应性进行了研究 ,同时进行了狂犬病毒在Vero细胞上繁殖最适条件的选择实验。 结果 狂犬病固定毒 3aG株在Vero细胞上多次传代后得到高滴度表达毒力可达 8 3LogLD50 /ml,具有较好的抗原性及免疫原性 ,并且确定了狂犬病病毒在Vero细胞上繁殖的最适条件 ,即种毒量在 0 1～ 0 0 1LD50 /cell之间病毒滴度最高。 结论 3aG -V毒株在Vero细胞上繁殖可维持相当长时间 ,并可进行多次加液 ,检测证实多次收获毒液毒力均达到疫苗制造要求。

狂犬病毒aG株在Vero细胞上传代适应研究

为研制有效、安全和稳定的Vero细胞狂犬病疫苗提供实验室基础资料。采用狂犬病固定毒4aG株在Vero细胞上进行传代适应,同时对该毒株在Vero细胞上的增殖条件,病毒液的回收方法进行研究。结果显示,狂犬病固定毒4aG株在Vero细胞上多次传代后获得一株Vero细胞适应株(4aG-V株),该毒株的毒力可达8.50 logLD50/ml,且具有很好的抗原性及免疫原性。结果表明,感染Vero细胞最适种毒比例为1∶103,病毒滴度随着时间的延长而增强到第12天后逐渐减弱,且采用低温冻融破碎法回收的病毒液滴度优于直接收液法。4aG-V株在Vero细胞上维持时间长,可连续收液,有望其生产高滴度的狂犬病毒液。

肾综合征出血热病毒LR1株在Vero细胞上适应的特性研究

选取不同代次的ＬＲ１毒株在Ｖｅｒｏ细胞上传代适应，不同天数连续动态观察细胞病变情况，同时用免疫荧光法和ＥＬＩＳＡ进行抗原检测，收毒前细胞反复冻融及超声波破碎，细胞破碎前后用ＥＬＩＳＡ检测抗原含量，半微量空斑法检测病毒滴度。结果证明：ＬＲ１株病毒能在Ｖｅｒｏ细胞上产生细胞病变，病变程度与其毒力明显相关；ＬＲ１株病毒在Ｖｅｒｏ细胞上繁殖的最佳收毒时间为１１天左右；病毒释放性较差。

Vero细胞狂犬疫苗的研制

利用自建的狂犬病毒Vero细胞适应株和细胞反应器微载体系统培养Vero细胞和狂犬病毒，病毒滴度达到6．0～8．0log(10)LD(50)／ml。病毒原液纯化后制出的纯化狂犬疫苗质量基本上均能达到WHO对此类型疫苗的主要质控要求。表明疫苗小量试制工艺基本可行。

重组人禽流感H7N9疫苗株在Vero细胞上的适应性和传代稳定性研究

本文主要研究重组人感染高致病性禽流感H7N9株作为主工作种子批在Vero细胞连续传代中的高产特性和传代稳定性,为疫苗开发提供前期研究。将重组获得的H7N9流感病毒Vero细胞适应株(A/Anhui/1/2013Va)按照病毒感染复数(MOI)0.01的病毒量接种于Vero细胞,并连续传15代。血凝试验检测每代病毒血凝效价,并绘制病毒在Vero细胞上的生长曲线;每代病毒用MDCK细胞检测病毒的感染性滴度;通过单向免疫扩散试验对重组病毒H7N9的第1及第16代进行型别鉴定;取第1、5及16代病毒,用鸡胚半数感染量及致死量检测病毒在传代过程中毒力变化;分别提取第1和16代H7N9流感病毒的RNA,反转录及克隆后测序,对比病毒在连续传代过程中血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因的变化。试验结果表明:在连续传代过程中,病毒效价越来越趋于稳定,血凝效价稳定维持在384~448;病毒感染性滴度维持在7 Log10TCID50/mL左右;病毒在传代过程中毒力未发生显著变化;HA和NA在连续传代过程中并未出现因基因变异导致的编码氨基酸改变的状况。H7N9安徽株病毒在Vero细胞传代过程中不仅产量稳定,其毒力和基因也很稳定,可以将其作为H7N9流感疫苗候选株。

水痘-带状疱疹病毒疫苗株在Vero细胞中的传代适应

目的探索水痘-带状疱疹病毒(VZV)疫苗株在Vero细胞中的传代适应及大量制备抗原的可行性。方法以VZV疫苗株在Vero细胞中传代适应,并检测适应株的生物学性状,采用15L旋转培养瓶培养,大量制备VZV ELISA抗原,并检测抗原的特异性。结果VZV疫苗株在Vero细胞中传代至第9代时,CPE明显增多,病毒滴度从2～3logPFU/ml提高到不低于4·2logPFU/ml。所制备毒种的适宜MOI为0·01,在72h左右收获的病毒滴度较高。毒种在-70℃保存1年后,病毒滴度未显著降低。抗VZV阳性血清检测证实制备的抗原具有较好特异性,抗原最适稀释浓度为1:4000。结论VZV疫苗株在Vero细胞中能传代适应,并可用15L瓶旋转培养大量制备VZV抗原。

禽呼肠孤病毒强毒株和弱毒疫苗株感染Vero细胞的蛋白质组学研究

为研究在禽呼肠孤病毒(ARV)不同毒力毒株感染后不同时间点宿主细胞中蛋白质组变化,运用双向凝胶电泳技术和质谱鉴定的蛋白质组学方法,对ARV强毒株S1133、弱毒疫苗株aS1133感染Vero细胞和对照细胞在不同时间点的蛋白质样品进行检测。鉴定结果表明,共鉴定出44个差异表达蛋白质,这些蛋白质包括α-烯醇化酶(α-enolase)、过氧化物酶(Prx-4)、hnRNPs、微管蛋白(Tubulin)、蛋白磷酸酶、转录延伸因子等。GO软件分析显示这些差异蛋白质主要参与细胞信号、细胞骨架组成、能量代谢、核酸代谢、蛋白质折叠、细胞增殖及凋亡等生物学功能。荧光定量RT-PCR验证表明,hnRNP和Prx-4在S1133感染细胞中表达水平持续上调,而Tubulin和α-enolase仅分别在48和24h时表达上调,与双向凝胶电泳的结果一致。以上试验数据揭示了ARV不同毒力毒株感染后细胞中蛋白质表达的差异变化,有助于进一步阐明ARV和宿主之间的相互作用。

甲型肝炎病毒Vero细胞适应株的选育研究

将甲肝患者粪便中分离的甲型肝炎病毒在Vero细胞中进行适应性培养 ,选育高滴度适应株应用于甲肝灭活疫苗研究。在Vero细胞上连续传代 ,测抗原滴度和感染性滴度 ,满意后按WHO推荐的甲型肝炎灭活疫苗规程进行灭活疫苗试制研究。经Vero细胞 14次适应性传代后 ,病毒抗原滴度可高达 1∶2 5 6 0 ,感染性滴度为 8.2 3LogC CID50 /ml。试制的灭活疫苗HPSEC检测在 2 80nm时仅有一个高峰 ,SDS PAGE电泳 ,在 2 2kD、2 6kD和 33kD处有三条蛋白带 ,和HAVVP3、VP2和VP1的位置相同。ICR小鼠效力试验表明疫苗剂量 16 0 0EU/ml与Merck疫苗5 0U效果相似。通过研究获得了Vero细胞甲肝病毒适应株YN5株 ,初步证明可作为甲型肝炎灭活疫苗的候选毒株。

狂犬病毒CTN-1株在Vero细胞上的适应传代

以我国狂犬病固定毒人二倍体细胞适应株 (CTN - 1)作Vero细胞适应传代研究。显示CTN - 1株能较好适应Vero细胞 ,经 5代培养病毒滴度可达 7 5logLD5 0 /ml,且在 5～ 2 0代以内均稳定在 7 0logLD5 0 /ml左右 。

冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液(无人白)体积分子排阻-高效液相色谱主峰右侧峰2蛋白鉴定

目的对冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液(无人白)体积分子排阻-高效液相色谱(size exclusion chromatograghy-high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)主峰右侧峰2蛋白进行鉴定,以明确该峰的蛋白成分,保证疫苗质量。方法将冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液(无人白)进行SEC-HPLC分析,收集主峰右侧峰2,经超滤浓缩后,进行二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)还原、碘代乙酰胺(iodoacetamide,IAM)烷基化和胰蛋白酶(Trypsin)酶解,产物进行nanoLC-MS/MS串联质谱分析。结果冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液(无人白)SEC-HPLC主峰右侧峰2成功鉴定4个蛋白,单个蛋白匹配肽段数在59~79个之间;单个蛋白匹配特征肽段种数在6~12种之间;单个蛋白匹配特征肽段检出次数在20~36次之间;鉴定蛋白的序列覆盖率在37.40%~64.31%之间。参与统计的肽段共280个,质谱偏差均小于0.15 Da。结论冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液(无人白)SEC-HPLC主峰右侧峰2均来源于狂犬病病毒株4aGV,为疫苗颗粒解离物。

仙台病毒高滴度病毒制备方法的建立

目的:建立使用传代细胞稳定大量地制备高滴度的仙台病毒(SeV)的方法,取代成本高、周期长、操作繁琐、易污染的鸡胚制备仙台病毒的方法,用于实验研究。方法:首先观测不同细胞感染仙台病毒后发生病变的时间、程度以及产毒量,确定仙台病毒敏感细胞株并确定病毒产量高峰期,连续在细胞中传3代测量上述指标。其次观测染毒时病毒吸附时间不同对病毒滴度的影响。综合分析后建立制备高滴度仙台病毒的方法。结果:大鼠脑胶质瘤细胞C6株对仙台病毒高度敏感,细胞出现病变所需时间短且明显,病毒产量最高。仙台病毒滴度与染毒时的吸附时间呈正相关,病毒最佳吸附时间为90min。接种病毒后72h收获的病毒滴度最高,平均为11TCID50,并且病毒可以在细胞内连续稳定传代。结论:确认大鼠脑胶质瘤细胞C6株为仙台病毒的敏感细胞,且病变快、明显,病毒产量高。为在体外深入研究仙台病毒和大量繁殖高滴度仙台病毒提供了实验方法。

生物反应器培养轮状病毒基因重配株Ls条件的优化

目的轮状病毒基因重配株Ls(G3型)在生物反应器微载体培养Vero细胞条件的优化。方法采用3 L生物反应器微载体培养Vero细胞,观察Ls株在不同病毒感染复数(0.001、0.002、0.010、0.040 MOI)、不同温度(34.5℃和35.5℃)、不同病毒收获时间(24和48 h)对病毒增殖的影响。根据病毒滴度和收获量筛选出最适MOI、培养温度及病毒的收获时间。结果以0.002 MOI接种Vero细胞,温度为34.5℃培养病毒,滴度最高达7.50 lg CCID50/m L;48 h可连续收获4次病毒液,且收获总量及病毒滴度均高于24 h。结论通过对Ls株在生物反应器微载体Vero细胞培养条件的优化,获得的病毒液滴度高及连续培养多次收获量增加的有效方法,为进一步规模化培养奠定了基础。

HFRS病毒Z_(37)株在绿猴肾传代细胞的病变作用和传代适应

〔目的〕研究肾综合征出血热 (HFRS)病毒Z3 7疫苗株在绿猴肾传代细胞 (vero ,vero -E6)上的病变和传代适应增殖情况 ,为应用vero细胞研制出血热疫苗提供科学依据。〔方法〕将肾综合征出血热疫苗株Z3 7适应在绿猴肾传代细胞 (vero ,vero-E6)上 ,对细胞进行细胞病变 (CPE)的动态观察 ,并于不同的时间取样 ,测定病毒滴度 ,比较静置培养、转瓶培养滴度的差异情况。〔结果〕Z3 7株不使vero -E6细胞产生病变 ,用HEPES诱导 ,3d可见明显病变现象。Z3 7株不使vero细胞产生病变 ,用HEPES诱导病变现象未获成功 ,Z3 7株在vero细胞中可高滴度繁殖 ,滴度达到 10 7/ml,转瓶培养病毒滴度略高于静置培养。

猪乙脑传代细胞活疫苗(SAI4-14-2株)对仔猪的安全性试验

评价以Vero细胞为基质的猪乙脑传代细胞活疫苗（SA14-14-2株）对仔猪的安全性,将猪乙脑传代细胞活疫苗,通过1次超剂量（10倍剂量）免疫40～45日龄的仔猪,同时设立病毒液组、冻干保护剂组、空白对照组,监测仔猪体温和临床症状,采集免疫前和免疫后第1、2、3、5、7天血浆,仔猪于免疫后第14天无菌取脑组织.对采集的血样及脑组织进行蚀斑检测,并对血样及脑组织盲传3代的细胞培养液进行RT-PCR检测.结果,试验猪免疫前后临床观察、体温,免疫后接种部位均未见异常.蚀斑法和RT-PCR法检测各试验组仔猪血浆和脑组织提取液均未检出乙脑病毒.表明以Vero细胞为基质的猪乙脑传代细胞活疫苗（SA14-14-2株）对仔猪是安全的.

ELISA试剂盒检测Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗Vero细胞宿主蛋白残留量的验证

目的验证ELISA试剂盒检测Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(Sabin strain inactivated poliovirus vaccine,sIPV)中Vero细胞宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)残留量的适用性。方法用同一批ELISA试剂盒检测sIPV中Vero细胞HCP残留量,验证其专属性、重复性、中间精密度、准确度、线性、范围、定量限和耐用性等指标。结果将样品用2种不同稀释液(样品稀释液和疫苗稀释液)稀释后,检测Vero细胞HCP残留量结果均<12.5 ng/mL,表明该方法专属性强;同一检验人员检测同一样品6次,Vero细胞HCP残留量结果均<12.5 ng/mL;不同检验人员检测同一样品6次,Vero细胞HCP残留量结果均<12.5 ng/mL,表明具有良好的重复性和中间精密度;准确度试验中回收率均在99%~106%,CV为2%;在12.5~400.0 ng/mL的线性范围内,标准曲线线性良好(R^(2)>0.98);定量限为50.0 ng/mL;显色时间在25~35 min内对实验无影响,显色温度在36~37℃内对实验无影响,耐用性良好。结论ELISA试剂盒检测sIPV中Vero细胞HCP残留量具有较好的专属性、重复性、中间精密度、准确度、线性和耐用性,可用于sIPV中Vero细胞HCP残留量的检测。

汉坦病毒在Vero细胞上的适应传代及疫苗候选株的选育

目的 选育出在Vero细胞上繁殖力强、免疫原性和抗原性好的汉滩病毒及汉城病毒候选株。方法 国内外分离的 16株汉坦病毒 (HV)在Vero细胞上进行连续终末稀释传代 ,研究各毒株的繁殖特性及传代后病毒滴度及抗原量的变化。结果 经过 5次终末稀释传代 ,选育出L99(汉城病毒 )和 84FLi(汉滩病毒 ) 2株滴度高且稳定的病毒 ,在Vero细胞上具有良好的适应性 ,7～ 10d毒力接近峰值。ELISA测抗原量高峰则在 10～ 16d。病毒繁殖与接种剂量明显相关 ,0 0 1～ 0 1TCID50 /细胞感染量最宜。用这两个毒株试制的原液苗免疫家兔 ,产生的免疫血清 ,对同型毒株的中和效价均 >1∶10。结论 选育出滴度高和抗原性好的HV并试制出原液苗 ,为利用Vero细胞生产浓缩纯化灭活疫苗准备了条件。