人VIGILINN端融合蛋白的表达及亚细胞定位

目的原核表达人VIGILINN端基因,制备抗人VIGILIN的多克隆抗体,对人VIGILIN作亚细胞定位。方法用PCR扩增人VIGILIN基因N端,克隆到表达载体pGEX-4T-2中,并在大肠杆菌中以IPTG诱导表达。产物经Glutathion Sepharose 4B纯化后免疫新西兰白兔制备抗人VIGILINN端融合蛋白抗体,采用ELISA和Western blot鉴定抗体的效价及特异性。通过细胞免疫荧光染色,观察VIGILIN在细胞中的分布。结果在28℃1、mmol/L IPTG诱导3 h的最优条件下成功表达GST-VIGILIN N端融合蛋白,抗体ELISA滴度为1∶16000,Western blot证实抗体特异性较高,VIGILIN在细胞质和核中均有分布,核中的分布集中在核膜内侧和靠近DAPI染色显著的区域。结论成功表达人VIGILIN N端融合蛋白和制备兔抗人VIGILIN抗体,并应用于亚细胞定位,为研究人VIGILIN的性质和功能奠定基础。

人DOC-2氨基端PID结构域的克隆与原核表达

目的 :克隆人DOC 2氨基端PID结构域 (暂命名为nDOC 2 ) ,并在原核细胞中表达。方法 :用RT PCR从正常人卵巢组织中扩增nDOC 2基因 ,并克隆到载体 pUC 19中。经测序证实后 ,用BamHI/EcoRI双酶切 ,亚克隆到原核表达载体 pGEX 4T 1,并转化E .coliDH5α菌株。取工程菌 ,用IPTG诱导表达 ,对表达产物进行SDS PAGE鉴定。结果 :①经RT PCR、测序和酶切鉴定 ,成功地克隆了人nDOC 2基因。②经IPTG诱导的重组质粒pGEX 4T nDOC 2表达出相对分子质量 (Mr)约为 5 0 0 0 0的融合蛋白 ,与预期的结果相符。结论 :成功克隆到人DOC 2氨基端PID结构域 ,并在E .coliDH5α中表达出GST nDOC

HER-2/neu胞外配体结合区基因的克隆及原核表达

目的 克隆HER 2 /neu胞外配体结合区基因 ,并在大肠杆菌中获得高效表达。方法 用PCR技术扩增HER 2 /neu胞外配体结合区的cDNA片段 ,并将该片段插入pET 2 8a(+)原核表达载体中 ,实现插入基因的融合表达 ;用SDS PAGE和蛋白免疫印迹法分别测定表达产物的相对分子质量及特异性。结果 构建的重组质粒在大肠杆菌中获得高效稳定的表达 ,表达产物的相对分子质量与预期值一致 ,且所表达蛋白可被抗HER 2 /neu的特异性抗体识别。结论 获得了HER 2 /neu胞外配体结合区基因在原核系统中的表达 ,为HER 2

水稻甲基结合蛋白基因MBD701的克隆及原核表达

甲基结合域蛋白MBD作为与甲基化位点特异结合的重要反式作用因子,在植物生长发育中发挥着重要的调控作用.为了探讨MBD基因的结构与功能,利用RT-PCR方法克隆了水稻中编码甲基结合蛋白基因MBD701,构建了MBD701的原核表达载体pGEX-MBD701,并在大肠杆菌BL21(DE3)工程菌株中实现了融合蛋白GST-MBD701的表达.结果表明,MBD701除了包含典型的甲基结合域(第138～212)外,还包含CW的锌指结构(第73～132);在37℃,1 mmol/L IPTG浓度条件下成功诱导表达了大小为65.87 kD的GST-MBD701融合蛋白,这为进一步开展MBD701的蛋白纯化和功能分析奠定了基础.

北京长白杂交猪IgGH链基因CH2-CH3的克隆、序列分析及表达质粒构建

根据GenBank中注册的猪IgG H链基因cDNA CH2 CH3序列(SSU03780),设计了含KpnⅠ和HindⅢ酶切位点的一对引物,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法从北京长白杂交猪肠系膜淋巴结细胞扩增猪IgG H链基因CH2 CH3序列.将PCR产物纯化回收后,插入到含LacZ基因的克隆载体pGEM-T Easy中,转化大肠杆菌JM 109感受态细胞,经KpnⅠ和HindⅢ双酶切及PCR鉴定,筛选出阳性克隆.将所克隆的目的片断亚克隆到原核表达载体pQE 30,构建重组质粒pQE 30/PIgG CH2 CH3.将重组表达质粒转化大肠杆菌JM 109感受态细胞,筛选阳性克隆,经IPTG诱导表达后,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析.结果表明,本研究克隆了猪IgG H链基因CH2 CH3序列,全长663 bp,编码221个氨基酸,利用Gentyx version 6.0软件将CH2 CH3基因的核苷酸序列与GenBank中的参考序列比较,其核苷酸序列同源率为99.551%,推导的氨基酸序列同源率为100%.将pQE 30/PIgG CH2 CH3转化JM 109感受态细胞,表达的融合蛋白相对分子质量约为26.95 ku,经IPTG诱导2 h,表达量约占菌体总蛋白41.5%.

新城疫病毒HN基因功能结构域的原核表达

本研究对新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)分离株sc05的HN基因进行了克隆、序列测定,在此基础上将其C端功能结构域76-571aa片段亚克隆到pET32a(+)表达载体上,构建重组表达质粒pET32a-HN,鉴定正确后转化进BL21plysS(DE3)细胞,筛选出阳性克隆,用1mmol/L IPTG诱导表达,并对表达产物进行鉴定。SDS-PAGE电泳结果显示,HN基因功能结构域片段在BL21plysS(DE3)细胞中实现融合表达,表达产物大小约为76ku,Western blotting试验证实其能与NDV阳性血清反应。本研究为进一步研究HN蛋白功能结构域的免疫原性和研制鸡新城疫HN基因工程疫苗奠定了基础。

西藏小型猪Leptin及其受体胞外区片段的克隆及原核表达

目的克隆及原核表达西藏小型猪瘦素(Leptin)成熟肽及瘦素受体胞外区片段。方法根据西藏小型猪瘦素序列(GenBank号:GQ240885.1)和猪瘦素受体基因胞外域序列(GenBank号:AF167719.1)分别设计并合成两对引物扩增瘦素、瘦素受体基因胞外域编码区1654-2319位片段,以西藏小型猪组织总RNA为模板,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法获得了特异性片段。再以该两个特异性片段为模板,另外设计两对带有BanHⅠ和HidⅢ酶切位点的套式引物分别扩增瘦素64-504位(成熟肽编码区)和瘦素受体基因胞外域编码区1655-2314位的cDNA片段,将该两片段克隆入pMD18-T载体并转化感受态细菌E.coli DH5α测序并永久保存。此两片段经酶切后克隆到表达载体pRSET A的BamHⅠ和HindⅢ两酶切位点之间,构建重组质粒pR-OB和pR-OBR-a并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中表达,SDS-PAGE电泳鉴定表达产物。结果在IPTG诱导下促使重组菌pR-OB表达了相对分子质量约18×103左右的融合蛋白;重组菌pR-OBR-a表达了相对分子质量约27×103左右的融合蛋白。结论说明重组质粒pR-OB、pR-OBR-a在大肠杆菌BL21(DE3)中分别可表达西藏小型猪瘦素成熟肽、瘦素受体片段蛋白,为进一步研究瘦素、瘦素受体功能和应用提供了基础。

斑点叉尾鮰BPI抗菌肽的cDNA克隆及原核表达载体的构建

杀菌/渗透增强蛋白(bactericidal/permeability increasing protein,BPI)是生物机体细胞中表达的一种能够特异性杀灭革兰氏阴性菌的抗菌类蛋白,该蛋白包括氨基端和羧基端两个结构域,其中氨基端结构域主要承担杀菌和中和内毒素的功能。参考已经报道的对人类BPI进行重组DNA表达的研究结果,首先通过RT-PCR和巢式PCR从斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)鳃中克隆了编码BPI氨基端活性结构域的cDNA片段"BPI_(Ntd)",该片段由175个氨基酸残基组成,其中63个氨基酸残基在空间上形成一个非极性的脂质结合袋,与革兰氏阴性菌外膜上脂多糖(LPS)结合,从而改变细菌膜的通透性,达到杀菌的效果。根据斑点叉尾鮰与其他生物之间BPI氨基酸序列的比对结果,发现氨基端存在40个保守的氨基酸残基,其中9个高度保守的残基位于脂多糖结合区域内。为了进一步建立原核表达系统,根据pET-32a(+)和pET-28a(+)两种质粒的不同特点,选择其作为原核表达质粒,将"BPI_(Ntd)"片段分别插入两种质粒,通过菌落PCR、EcoRⅠ和HindⅢ双酶切反应以及DNA测序等方法,证明了重组表达质粒"pET-32a-BPI_(Ntd)"和"pET-28a-BPI_(Ntd)"已被成功构建。

小菜蛾钙黏蛋白PxCR_(10-11)结构域的克隆、原核表达及功能分析

钙黏蛋白(cadherin)是一类跨膜糖蛋白,因其在苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)的杀虫过程中作为主要的受体而受到广泛研究.钙黏蛋白的特征之一是由若干钙黏蛋白重复单元(cadherin repeats,CR)组成的长链状蛋白,其中靠近细胞膜的CR结构域被认为是钙黏蛋白与Bt毒素发生互作的区域.小菜蛾(Plutella xylostella)钙黏蛋白由11个CR结构域和1个跨膜结构域组成,其中第10和11个CR结构域PxCR_(10-11)被认为是钙黏蛋白与Bt毒素的互作区域.本研究从小菜蛾中肠cDNA中克隆得到小菜蛾钙黏蛋白PxCR_(10-11)结构域的DNA片段,并通过原核表达系统对PxCR_(10-11)结构域进行表达.配体印迹结果表明PxCR_(10-11)可以特异性和Cry2Ab结合;杀虫实验结果表明PxCR_(10-11)能提高Cry2Ab对小菜蛾的毒力.此外,利用蛋白质同源建模和糖基化位点预测网站对PxCR_(10-11)蛋白质结构进行了分析.上述结果表明PxCR_(10-11)可能参与了Cry2Ab毒素对小菜蛾的毒杀过程,为后续研究小菜蛾钙黏蛋白和Cry2Ab的相互作用机制奠定了基础.

HLA-A胞外区成熟肽基因的克隆及其原核表达载体的构建

根据GenBank基因库中HLA-A胞外区成熟肽基因序列设计2对引物,用RT-PCR法从健康人血液中扩增HLA-A胞外区基因,扩增产物进行T-A克隆、测序.结果表明,获得的HLA-A胞外区基因大小为819bp,与模板序列的同源性为96%.利用基因重组技术,将HLA-A胞外区基因亚克隆入pET-21a(+)载体中.经PCR、酶切和测序鉴定,证实所获重组表达质粒pET–21/HLA-A中含有目的片段,且连接、构建正确,表明成功构建了重组表达质粒pET–21/HLA-A.

粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶(ACC)基因的克隆及CT功能域基因的原核表达

利用简并PCR结合染色体步移法首次克隆获得粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶(ACC)基因的全长序列信息。序列分析表明,该基因包含2个内含子,分别位于42～147 bp和315～677 bp处,编码区域总长为6 801bp,推导的氨基酸序列进行二级结构分析具备乙酰辅酶A羧化酶典型的3个功能域:生物素羧化酶(BC)、生物素羧基载体蛋白(BCCP)和羧基转移酶(CT)。克隆该基因的CT功能域基因,连接到原核表达载体pET-28a上,在Escherichia coli BL21(DE3)中成功表达,利用Ni-NTA树脂柱纯化获得CT的可溶性重组蛋白,浓度为1.8mg/mL,为研究ACC的功能和针对CT作用的除草剂机理研究提供了有价值的材料。

微小隐孢子虫LCCL结构域基因的克隆及原核表达

为探讨微小隐孢子虫的入侵机制,克隆、表达了微小隐孢子虫LCCL结构域基因。从已构建的微小隐孢子虫cDNA文库中,采用PCR随机扩增LCCL结构域基因。与Pmd-18-T载体连接后,挑取阳性重组子测序分析。用基因重组技术将LCCL结构域基因克隆入原核表达载体pGEX-4T-1中,构建LCCL结构域基因的重组原核表达载体pGEX-4T-1-LCCL。重组质粒经酶切、测序鉴定后转入大肠埃希菌BL21中,IPTG诱导表达目的蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。最终得到了在大肠埃希菌中高效表达的重组蛋白,分子质量大小约为37ku,并且具有反应原性,为进一步研究微小隐孢子虫的入侵机制奠定了基础。

小鼠PGRP-L分子PGRP结构域基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的克隆小鼠长型肽聚糖识别蛋白(PGRP-L)的PGRP结构域基因并在大肠杆菌中表达。方法采用RT-PCR技术,从Balb／C小鼠肝组织总RNA中扩增PGRP-L的PGRP结构域基因片段,将其克隆入pUCm-T载体,以PCR、酶切和测序进行鉴定。以PCR从含PGRP结构域基因的重组质粒中扩增目的基因片段,插入表达质粒pQE-30构建重组表达质粒,转化大肠杆菌M15,诱导表达并纯化目的蛋白。结果 RT-PCR扩增得到约500bp的基因片段,将其与pUCm-T 载体连接构建成重组质粒pmPGRPd,其酶切图谱与计算机分析结果一致,该基因片段长518 bp,序列与Genbank中相应基因序列相同。构建成重组表达载体pQE-PGRPd,在大肠杆菌M15中表达,表达产物主要存在于菌体裂解液上清中,为一相对分子质量约29 000的可溶性蛋白。结论成功克隆并原核表达了小鼠PGRP-L分子PGRP结构域基因,为 PGRP-L分子的研究奠定了一定基础。

铜绿假单胞菌含Pilz结构域蛋白基因的克隆及原核表达

目的克隆铜绿假单胞菌含Pilz结构域蛋白基因并构建其原核表达载体,为进一步研究这七种含Pilz结构域蛋白是否为第二信使c-di-GMP潜在的受体分子奠定实验基础。方法提取铜绿假单胞菌PAO1基因组DNA,用PCR方法从中扩增出七种功能未知的含Pilz结构域蛋白基因,将其克隆到原核表达载体pET32a中,在大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定。结果成功扩增出七种含Pilz结构域蛋白基因并构建其原核表达载体,测序结果与NCBI数据库收录序列相一致。SDS-PAGE检验证明目的基因在大肠杆菌BL21中获得高效表达。结论从铜绿假单胞菌基因组中成功地克隆了七种含Pilz结构域蛋白基因,其构建的原核表达载体在大肠杆菌BL21中获得了高效表达。

鸡IL-2受体α亚基成熟蛋白基因的克隆及其胞外段的原核表达

以鸡脾淋巴细胞总RNA为模板，采用RT—PCR方法克隆了鸡白细胞介素-2受体α亚基（ChIL-2Rα）编码区基因。将ChIL-2Rα胞外段基因克隆到pET-32a（＋）中，获得重组质粒pET32a—exChIL-2Rα，转化宿主菌E．coli Rosseta^TM（DE3）后，经IPTG诱导表达的融合蛋白大小约为34ku。序列分析发现，鸡IL-2Rα编码区基因与GenBank上已登录序列的核苷酸同源性为99．2％，氨基酸同源性为99．5％。ChIL-2Rα与其他哺乳动物IL-2Rα在核苷酸和氨基酸水平上的同源性分别为29．6％～54．5％和18．8％～28．0％。表明，禽类IL-2Rα与哺乳类的差异较大。

鸭RIG-Ⅰ蛋白C端helicase结构域和RD结构域的原核表达及其单克隆抗体的制备

利用PCR技术将鸭维甲酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)helicase区和RD区部分编码序列分别进行扩增,并分别命名为c、d段;克隆到p ET30a原核表达载体,构建了重组原核表达质粒p ET30a-c和p ET30a-d,通过转化BL21(DE3)感受态菌、IPTG诱导、镍柱纯化表达蛋白,将纯化的c、d蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体(m Ab),采用ELISA、Western blot和间接免疫荧光试验对单克隆抗体进行鉴定分析。获得鼠抗鸭RIG-Ⅰ单克隆抗体有14株与原核分段表达的c、d蛋白有良好的反应性,其中3株与真核表达的RIG-Ⅰ蛋白有良好的反应性。制备的鼠抗鸭RIG-Ⅰ单克隆抗体为RIG-Ⅰ在抗病毒天然免疫信号转导途径的研究奠定了基础。

人VIGILIN基因分段克隆及表达

目的探讨人高密度脂蛋白结合蛋白(HDLBP)-VIGILIN蛋白与其他蛋白质相互作用的机制。方法根据VIGILIN基因全长编码区的结构域,将VIGILIN基因全长编码区分为N端、KH1-7、KH8-12、KH13-14、C端5段,以pDsred2-N1/VIGILIN为模板分别扩增5个片段及全长cDNA后克隆至pGEX 5X3原核表达载体,测序,然后将鉴定后的重组质粒转化到表达宿主菌E.coli BL21中进行诱导表达GST-VIGILIN融合蛋白,并用SDSPAGE电泳及Western blot检测蛋白表达结果。结果成功扩增了人VIGILIN基因编码区分段片段,并且构建到原核表达载体中,经酶切、测序鉴定证实序列完全正确,重组载体构建成功,并且在pGEX原核表达系统中诱导表达GST-VIGILIN融合蛋白,经SDS-PAGE电泳及Western blot检测初步证实表达成功。结论本实验首次根据VIGILIN蛋白不同的结构域成功构建了GST-VIGILIN分段克隆原核表达载体,并且对融合蛋白表达条件进行了优化,成功表达了GST融合蛋白。

鸡CTLA-4胞外区的原核表达与免疫佐剂作用

为了探索鸡细胞毒性T细胞相关抗原-4(CTLA-4)胞外区(ChIgV)作为免疫佐剂的可行性,采用RT-PCR从鸡外周血淋巴细胞扩增ChIgV编码序列;测序结果显示,其核苷酸序列与已发表序列的同源性为100%。将猪CD151基因片段克隆入原核表达载体pET-30a和ChIgV融合表达载体pET-ChIgV,获得重组表达载体pET-CD151和pET-ChIgV-CD151。分别将pET-CD151和pET-ChIgV-CD151转化BL21(DE3)大肠杆菌,用IPTG诱导重组菌表达,SDS-PAGE结果显示,能表达预期的18ku和28ku重组蛋白,表达产物均为不溶性包涵体。采用包涵体纯化法和尿素变性/复性法获得了纯化的可溶性重组蛋白。以每只500μg剂量2次免疫SPF鸡,用间接ELISA测定血清抗体效价,结果显示,CD151免疫组在初免后第3周特异抗体检测为阳性,第5周抗体效价达到1∶13 000;ChIgV-CD151免疫组在初免后第2周特异抗体检测为阳性,第4周抗体效价达1∶53 000。分别用CD151和ChIgV-CD151免疫血清进行Western-blot检测,结果显示,均能在CD151阳性猪肺巨噬细胞膜蛋白中检测到预期的29ku蛋白条带,而在CD151阴性PK-15细胞膜蛋白中不能检测到相应的蛋白条带。表明,ChIgV可作为鸡抗原提呈细胞的靶向导入分子和新型免疫佐剂。

小鼠可溶性IL-5受体α胞外区基因的克隆及原核表达

目的克隆并原核表达小鼠可溶性IL-5受体α(sIL-5Rα)胞外区基因。方法采用RT-PCR从BALB/c小鼠脾脏组织中分别扩增sIL-5Rα胞外区前后段基因片段,酶切后将两段基因连接,插入原核表达载体pPROEX中,构建重组表达质粒pPROEX/sIL-5Rα,转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达。采用SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白的表达。结果重组表达质粒经双酶切和DNA测序,证实构建正确。表达的sIL-5Rα胞外区蛋白相对分子质量约36100,表达量约占菌体总蛋白的30%,且可与兔抗小鼠sIL-5Rα单抗发生特异性免疫反应。结论已成功克隆并原核表达了小鼠sIL-5Rα胞外区基因,为进一步探讨sIL-5Rα对哮喘的治疗作用及开发新的哮喘治疗药物奠定了基础。

带有HIV Tat-蛋白转导域的人成熟神经生长因子的分泌表达及鉴定

HIV-Tat蛋白转导域(protein transduction domain,PTD)是一个公认的具有介导靶蛋白跨膜作用的肽段。为了表达出可溶的并具有生物学活性的PTD-NGF融合蛋白,作者首先根据人神经生长因子成熟肽(hNGFm)的基因序列设计引物,利用PCR技术直接从人胎盘的基因组DNA中扩增出hNGFm的编码序列,同时利用PCR引物在其5和3末端分别加上HIV-Tat-PTD及组氨酸标签(His-Tag)的序列,然后将PCR产物克隆于原核表达质粒pET22b中pelB leader的下游,构建分泌表达质粒pET22b-PTD-hNGFm-His,将该质粒转入宿主大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE检测显示有两种表达产物,Mr分别为16ku和18.4ku,分别位于大肠杆菌周质腔和细胞质中,两者均可与抗hNGF抗体反应。周质腔表达产物(PTD-hNGFm-His)经Ni2+螯合亲和层析纯化后纯度达98%以上,纯化的PTD-hNGFm-His融合蛋白刺激神经突起生长的最适浓度为20ng/ml。因此成功构建了PTD-hNGFm-His分泌表达载体并在大肠杆菌中进行了分泌表达,得到了可溶且具有生物活性的PTD-hNGFm-His融合蛋白。