抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体可变区基因的克隆和序列分析

目的: 克隆并分析抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体(mAb)VH及VL基因。方法: 从分泌抗溶藻弧菌独特型mAb的杂交瘤细胞株 (AL1 )中提取总RNA。利用RT- PCR技术,克隆抗溶藻弧菌独特型mAbVH 和VL基因, 并将其重组入PMD18 Tvector中进行测序分析。结果: VH基因序列全长为369bp, 编码 123个氨基酸; VL基因序列全长为 339bp, 编码113个氨基酸。通过国际联机检索及Kabat库分析, 二者均符合小鼠IgGV区基因的特征, 含有 4个框架区 (FR), 3个抗原互补决定区 (CDR)及两个抗体特征性的半胱氨酸残基。结论: 抗溶藻弧菌独特型mAb的VH和VL基因的克隆成功,为抗溶藻弧菌独特型mAb基因工程疫苗的构建奠定了基础。

伴发副肿瘤性天疱疮的Castleman瘤B细胞免疫球蛋白基因重排与超变分析

目的 :我科近来研究了副肿瘤性天疱疮 (PNP)患者肿瘤在发病中的作用 ,证明 1例Castleman瘤产生针对表皮连接蛋白的抗体。本文进一步探讨肿瘤和抗体在疾病发生过程中的作用和PNP的发病机制。方法 :对 1例副肿瘤性天疱疮伴发已经证明可分泌自身反应性抗体的Castleman瘤患者肿瘤B细胞进行培养 ,免疫组化分析其表面标志 ;扩增患者肿瘤组织的RNA ,将PCR产物克隆、测序。对B细胞克隆的免疫球蛋白可变区基因重排和超变区突变特点进行分析。结果 :培养肿瘤细胞多数为CD2 0、HLA DR、smIgM、smIgG阳性。克隆得到IgVH 与IGHV3 9 0 1胚系基因片段接近 ,IgVL与IGKV4 1 0 1胚系基因片段同源。VH和VL 基因CDRs区的核苷酸改变均明显多于FRs区 ,并且在VH和VL 基因观察到的CDRs区替换突变数目远大于可能发生随机突变的值。结论 :本例伴发Castleman瘤的副肿瘤性天疱疮患者的肿瘤中存在特殊B细胞克隆 ,其已重排的免疫球蛋白可变区基因CDRs超变区发生明显体细胞突变 ,可能是抗原选择的结果。该克隆经过免疫球蛋白类别转换 ,可能直接产生与表皮自身抗原特异性结合的自身反应性IgG。

鸡脾细胞总RNA的提取及其V_H、V_L基因的扩增

由鸡脾脏淋巴细胞中提取总RNA,反围录合成cDNA第一链,以cDNA为模板,根据鸡抗体V_H、V_L基因中的5’端和J端序列,设计并合成体外扩增V_H、V_L基因的两对引物,进行RT-PCR,成功地扩增出V_H、V_L基因片段。为鸡源ScFv噬菌体库的构建打下基础。

抗隐孢子虫子孢子表膜单链抗体4G4的基因克隆及序列测定

应用RT PCR技术 ,从分泌抗隐孢子虫表膜单克隆抗体 (McAb)的杂交瘤细胞 4G4中 ,扩增出抗体VH 和VL 基因 ,用Linker (Gly4 Ser) 3基因 ,将VH 和VL 基因连接成ScFv基因 ,并将其克隆至pMD 18T载体中。经核甘酸序列分析证实 ,VH 和VL 基因及Linker基因拼接正确 ,基因全长 717bp ,经计算机分析 ,VH和VL 基因均为新发现的基因序列 。

抗肿瘤基因工程单链抗体及其免疫霉素的研究

抗体V_H基因和V_L基因经寡核苷酸接头连接成ScFv基因,转入原核或真核表达系统中表达ScFv.ScFv具有亲本抗体相同的抗原结合特性和能力,且抗原性大大减弱.ScFv分子量小,易穿入肿瘤和实体组织内部, 也易进入病毒峡谷.ScFv与药物、毒素、同位素或酶等偶联构成的导向治疗制剂在血中清除迅速,不残留于正常组织,尤其不在肾脏中积聚,因而毒副作用很小.PCR技术的应用,使制备单链兔疫毒素在二周内即可实现,大大缩短了导向药物的制备时间.改善培养条件,E.coli能表达并装配和折叠成具有生物活性的双价ScFv及其免疫毒素.

抗胃癌抗体轻链可变区序列测定和三维结构模建

目的:确定抗胃癌抗体轻链可变区(VL)的一级结构,并模建其三级结构. 方法:从抗人胃癌噬菌体抗体库中筛选出VL基因,并进行序列测定和分析.利用同源蛋白结构模建技术,采用计算机辅助分子设计系统模建VL的三维空间结构. 结果:所获得的VL序列符合鼠抗体可变区特征,并成功构建了其三维空间结构. 结论:所测得的VL一级结构和构建的三维空间结构均有较高的可靠性.

抗人核内不均一核糖核蛋白A2/B1抗体可变区基因克隆、串联和表达

目的克隆抗人核内不均一核糖核蛋白A2/B1(heterogeneousnuclearribonucleoproteinA2/B1,HnRNPA2/B1)单克隆抗体的重链可变区(variableregionofheavychain,VH)和轻链可变区(variableregionoflightchain,VL)基因,构建抗HnRNPA2/B1单链抗体(singlechainFv,ScFv)基因,并在大肠杆菌表达。方法采用斑点ELISA、Western印迹和免疫组化检测抗HnRNPA2/B1单克隆抗体3E8的特异性,并通过逆转录-聚合酶链反应、重叠延伸PCR来克隆、串联VH和VL基因,构建抗HnRNPA2/B1ScFv基因pET28(a+)表达载体,在大肠杆菌BL21中诱导表达,通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳、竞争抑制ELISA检测表达产物。结果3E8抗体能特异性地与HnRNPA2/B1合成肽以及3株人肺癌细胞内HnRNPA2/B1结合;克隆的VH基因为345bp,VL基因为309bp,符合小鼠抗体可变区特性;抗HnRNPA2/B1ScFv蛋白以包涵体形式表达,分子量约28000,并具有与抗原结合活性。结论成功构建了抗HnRNPA2/B1ScFv基因克隆,并在大肠杆菌中获得了功能性表达,为阐明HnRNPA2/B1与肺癌相关性奠定了实验基础。

抗心肌肌凝蛋白重链的单链抗体V_H和V_L基因的合成

目的为研制心肌显像剂—抗人心肌肌凝蛋白重链(HCMHC)的单链抗体,合成抗HCMHC单链抗体的VH和VL基因。方法用TRIZOL试剂从抗HCMHC McAb杂交瘤细胞提取总RNA,合成第一链cDNA,以这第一链cDNA为模板,用合成的特异引物、DNA聚合酶和四种单核苷酸,对重链可变区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因进行PCR扩增。对各步骤的产物进行鉴定,并做了对RNA的稳定性与贮存温度的关系,MgCl2浓度和循环温度的最优化的选择。结果合成的第一链cDNA纯度达95%;扩增产物的琼脂糖凝胶电泳带呈单一明亮泳带,VH和VL基因分子量分别为340bp和320bp,与文献相一致。结论成功合成了VH和VL基因,为心肌显像及其显像剂抗HCMHC单链可变区抗体的研究打下了基础。