2019-2022年我国部分地区鸡滑液囊支原体分离株基因分型及vlhA基因进化分析

为了解我国鸡滑液囊支原体(MS)的最新感染情况,试验对2019-2022年在我国河南、河北、山东、安徽、江苏5个省份收集的152份疑似MS感染的鸡病料进行MS分离鉴定,对分离的MS菌株进行基因分型,并对其vlhA基因5′端保守区域(76~421 nt)进行遗传进化分析。结果显示:共分离到29株MS菌株,除其中1株为E型外,其余28株均为L型;29株MS均处在一个大的进化分支,与国内流行菌株亲缘关系较近,与国外流行菌株亲缘关系较远。研究提示:近四年我国流行的MS菌株相对独立,各地流行菌株同源性较高。

我国部分地区鸡滑液囊支原体分离株vlhA基因遗传进化和同源性分析

为了探究鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)在我国的遗传变异情况,试验采集北京市、河南省、辽宁省、河北省、天津市、山东省、安徽省、江苏省、湖北省、江西省10个地区疑似感染MS的发病鸡上颚裂黏液,进行MS分离、纯培养及鉴定,采用PCR方法扩增阳性分离株vlhA基因片段并对其进行测序分析,利用MEGA 7.0软件构建分离株与GenBank中28株参考株的系统发育树并分析遗传进化关系,再利用MegAlign软件分析分离株和参考株vlhA基因的同源性。结果表明:共得到17株MS分离株,其中16株的基因型为K型,1株为L型。分离株与国外不同地区的参考株vlhA基因同源性较低,在71.8%~91.8%之间;与国内不同地区的参考株vlhA基因同源性较高,在82.3%~95.9%之间。说明目前在我国流行的MS分离株的优势基因型是K型,并存在一定变异。

川西地区鸡滑液囊支原体分离株的部分生物学特性及其VlhA基因遗传进化分析

为了解鸡滑液囊支原体(MS)在川西地区的感染情况,本研究采集15个肉鸡场疑似MS感染的病鸡咽拭子、跗关节和胸部滑液囊样本共75份,对经PCR检测为阳性的样本进行MS分离,并对分离株的主要生物学特性进行研究,以及对分离株的VlhA基因进行遗传进化分析。结果显示,75份样本MS PCR阳性检出率为41.33%(31/75),11个鸡场感染该病,场阳性率为73.33%(11/15);但仅从其中3个鸡场分离到9株MS,分离株菌落与菌体形态与已知MS培养特性相符,各分离株培养浓度为10~4CCU/mL^10~6CCU/mL,分离株以5×10~5CCU接种7日龄SPF鸡胚,鸡胚于接种后7 d^9 d死亡,且分离回收到接种菌株;9株MS分离株VlhA基因的同源性为86.1%~99.9%,与参考株同源性为86.2%~95.4%,其中分离自同一鸡场的7株MS VlhA基因同源性为96.4%~99.9%;分离株VlhA基因遗传进化分析显示,其中分离自两个不同鸡场的两株MS与国内流行株的亲缘关系最近,而分离自另一鸡场的7株MS与中东地区分离的3株MS亲缘关系较近,表明MS在川西地区肉鸡场呈高感染率,MS VlhA基因变异较大。本研究为川西地区MS的进一步研究提供了基础材料和科学依据。

鸡毒支原体VLHA3.03蛋白的原核表达及免疫原性分析

为研究鸡毒支原体(MG)的可变脂蛋白血凝素(VLHA)的生物学功能,对VLHA 3.03蛋白进行原核表达,然后进行了免疫原性和免疫反应性分析。通过Overlap PCR方法对MG Rlow株的vlha 3.03基因进行点突变扩增,将突变成功的vlha 3.03基因全长与原核表达载体pCold Ⅰ连接,连接产物转入大肠杆菌BL21进行诱导表达和纯化。用纯化后的重组蛋白rVLHA3.03免疫新西兰大白兔,制备兔多克隆抗体,并用ELISA检测抗体效价,再用制备的兔多克隆抗体、MG不同分离株阳性鸡血清及MS标准阳性血清分别与rVLHA3.03蛋白进行Western blot反应,分析rVLHA3.03蛋白的免疫原性和免疫反应性。结果表明,在大肠杆菌BL21中成功表达rVLHA3.03蛋白,且该蛋白具有较好的免疫原性和免疫反应性。

鸡毒支原体HS株粘膜免疫抗原VlhA4.12的重组表达及其功能结构预测

为筛选参与呼吸道局部免疫反应的鸡毒支原体(MG)抗原,本研究收集MG-HS株感染鸡的血清和呼吸道冲洗液,并以其为一抗,与MG菌体裂解物进行western blot检测。结果筛选到一个大小约为75 ku的抗原,质谱分析显示与MGR株的血凝素基因家族成员VlhA4.12同源,生物信息学分析显示存在多个B细胞和T细胞抗原表位。重组VlhA4.12中4个色氨酸密码子"TGA"进行同义突变,并在大肠杆菌中进行表达,结果显示表达产物能够与MG感染鸡呼吸道冲洗液中特异性IgA和IgY反应。VlhA4.12的筛选工作为新型MG疫苗抗原筛选提供新思路,也为粘膜免疫亚单位疫苗研制奠定了基础。

L型滑液囊支原体实时荧光定量PCR方法的建立与应用

为建立一种快速、灵敏的检测我国优势基因型(L型)滑液囊支原体(MS)的方法,试验针对L型MS vlh A基因核苷酸序列保守区设计引物及Taq Man-MGB探针,将PCR扩增的vlh A基因克隆至p MD19-T载体,构建重组质粒vlh A-L作为阳性质粒标准品,建立实时荧光定量PCR(q PCR)方法,并检验该方法的特异性、灵敏性和重复性。结果显示:该方法特异性良好,与C型MS-H株及其他鸡常见病原不发生交叉反应;重组质粒vlh A-L最小检出浓度为1.94×10^(1) copies/μL;组内和组间重复性变异系数均小于1%;临床样品检测结果与PCR测序结果吻合。研究表明,建立的q PCR方法特异性强、灵敏性高、重复性好,适用于检测我国L型MS感染情况,还可满足监测免疫MS-H株疫苗鸡群L型MS感染的要求。

4株滑液囊支原体分离株的分子鉴定及vlhA基因的序列分析

为了从分子水平对4株滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)分离株进行鉴定,同时分析其膜蛋白vlhA的基因序列以及蛋白的功能结构域。通过PCR扩增其16S rRNA和vlhA基因序列,以16S rRNA序列构建分子进化树并分析4株MS分离株和其他支原体参考株的同源性;利用生物信息学工具对vlhA基因的核酸序列和蛋白序列进行分析,查找其保守结构域,预测其可能具有的功能。结果表明,4株MS分离株在16S rRNA基因序列上与MS不同菌株具有同源性,可以确定为滑液囊支原体;其vlhA基因序列分为保守区和高变区,保守区和部分高变区组成主要膜抗原基因MSPB;vlhA蛋白共含有10个保守的结构域,7个保守域位于保守区,8个保守域位于MSPB区,其中的75 Asp^425 Asn之间的氨基酸残基预测与细胞黏附有关;75 Asp^126 Val与129 Val^206 Val之间的氨基酸残基为免疫球蛋白超家族结构,与受体/配体功能相关,可能都参与MS感染宿主的过程。

2016-2019年我国部分地区鸡滑液囊支原体分离株vlhA基因遗传进化分析

为了解我国鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)感染的最新流行情况,本研究于2016―2019年从江苏、安徽、山东、河南、河北、宁夏、黑龙江、湖北等8个省份疑似发生MS感染的鸡场采集样品,进行MS菌株的分离鉴定,结果共获得48株MS分离株。对这些分离株的vlhA基因片段测序和分析显示,其中46株均属于K基因型,另外2株分别属于A基因型和E基因型。研究结果表明,当前国内流行的MS优势基因型是K基因型,与其他国家和地区流行的基因型存在显著性差异。本研究结果为制定适合我国鸡群MS控制与净化的策略提供了必要的流行病学依据。

云南省某养鸡场疑似肉鸡感染滑液囊支原体病例的诊断

2022年3月云南省大理市某肉鸡规模化养殖场出现疑似肉鸡感染滑液囊支原体病例。为明确病因,对病死肉鸡病料进行滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)核酸检测和MS可变脂蛋白血凝素基因(variable lipoprotein hemagglutinin gene A,vlhA)序列分析。结果显示:6羽病死肉鸡的病料样品中均检测到MS核酸,仅1羽病死肉鸡病料样品(6号样品)检测到vlhA基因;vlhA基因序列(MS-VLHA-TSS20220711-0871-01253 GO7)与中国的CHN-JX-JX02-2014、CHN-JS01-2013、CHN-HN03-2013、CHN-GD-LZ01-2014和CHN-GD-LZ03-2014滑液囊支原体株95%同源,与泰国的AHRU2015CU3505.1及匈牙利的IZSVE/378/D13/1滑液囊支原体株94%同源。

鸡滑液囊支原体TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立及应用

为了快速、准确检测鸡滑液囊支原体(MS),对MS标准株vlhA基因进行分析,设计并合成特异性引物和探针,优化反应条件,构建了基于vlhA基因的TaqMan实时荧光定量PCR快速检测方法。结果显示,所构建方法标准曲线所对应的相关系数R^(2)=1.000,斜率S=-3.452,截距I=43.950,表明标准质粒浓度与Ct值的线性关系良好;该方法除MS外,其他参考菌(毒)株均无目的基因扩增,其最小检测浓度为1×10^(1)copies/μL,组内重复及组间重复的变异系数均低于0.1;运用所建立方法与普通PCR方法对4份疑似MS临床样本进行检测,检测结果完全相符合;应用该方法对贵州省7个地区107份疑似MS样本进行检测,发现总体阳性率为26.17%。说明建立的方法具有较好的特异性、敏感性和重复性,可应用于临床检测。

检测鸡毒支原体抗体的间接ELISA方法和HI试验方法的建立及初步应用

本研究旨在建立一种检测鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)抗体的间接ELISA方法,结合HI试验,为MG感染的监测和净化提供一套有效的组合技术方案。以原核表达的VlhA 3.03重组蛋白(rVlhA)作为包被抗原,使用单一稀释法构建了关于血清抗体滴度与1∶500血清稀释度处S/P值的回归方程lg(抗体滴度)=1.257×lg(1∶500处S/P值)+3.709,R^(2)=0.9176,S/P临界值为0.32,临界滴度是1200。经验证,rVlhA-ELISA方法具有良好的特异性、重复性,最低能检出1∶2000稀释的阳性血清。选择国内MG分离株SH/2020-1作为血凝抑制抗原建立HI试验方法。使用rVlhA-ELISA方法联合HI试验进行血清样品检测,IDEXX-MG方法作为对照,借助RT-qPCR方法监测MG感染情况。结果表明rVlhA-ELISA方法和IDEXX-MG监测的血清抗体趋势与HI复核结果均一致;rVlhA-ELISA与HI联合判定结果与IDEXX-MG符合率可达91.53%。上述结果显示,本研究建立的rVlhA-ELISA方法和HI试验具有较好的临床应用价值,可以初步应用于MG感染的临床大规模、快速筛查并对结果进行复核。

冀南地区滑液支原体分离鉴定及耐药性分析

【目的】了解中国冀南地区滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)的流行和耐药情况,为该地区防控MS感染提供科学依据。【方法】于2019—2022年采集冀南地区疑似MS感染的7个规模化鸡场样品(发病鸡的气囊、腭裂或爪垫渗出液)进行病原分离培养及PCR鉴定,对分离株进行vlhA基因分型序列分析,采用微量肉汤稀释法测定分离株最小抑菌浓度(MIC)。【结果】所采集样品中分离出9株疑似MS菌株,均可使液体培养基颜色变为橘黄,在固体培养基中菌落形态为典型的“煎荷包蛋”样;PCR鉴定及测序结果显示,9株分离株与MS HN01株相似性为100%,表明分离株均为MS;vlhA基因分型序列结果显示,9株MS富含脯氨酸重复序列(PRR)区均为35个氨基酸,属于L型,核苷酸序列相似性为99.7%~100%,与中国其他地区L型菌株亲缘关系较近,与泰国L型菌株亲缘关系较远;MIC测定结果显示,9株MS对泰乐菌素、替米考星、螺旋霉素、林可霉素、沃尼妙林、泰妙菌素、多西环素、土霉素、氟苯尼考、恩诺沙星的MIC 50/90值分别为0.25/0.25、0.5/0.5、0.5/0.5、1/1、≤0.016/≤0.016、0.062/0.125、1/1、2/2、4/4和32/32μg/mL。【结论】本研究于冀南地区成功分离到9株L型MS,与国内其他地区MS差异较小、遗传进化相对稳定,治疗当地MS感染可选用泰妙菌素、沃尼妙林、泰乐菌素、替米考星、螺旋霉素,其次为林可霉素、多西环素、土霉素。本研究结果可为当地防控MS感染提供科学依据。