铝佐剂对HBoV1 VP2 VLPs诱导小鼠免疫应答的影响

目的:探讨铝佐剂对HBoV1 VP2 VLPs诱导小鼠免疫应答的影响。方法:BABL/c小鼠随机分为VLPs实验组、明矾佐剂实验组、PBS对照组和明矾佐剂对照组。实验组小鼠分别采用HBoV1 VP2 VLPs和HBoV1 VP2 VLPs加明矾佐剂肌肉注射免疫,对照组小鼠同期注射等量明矾佐剂或PBS缓冲液;实验8周后ELISA检测两实验组特异性Ig G抗体效价和活性,ELIspot检测两实验组特异性细胞免疫反应强度,从细胞免疫和体液免疫强度探讨铝佐剂对HBoV1 VP2 VLPs诱导小鼠免疫应答的影响。结果:明矾佐剂降低HBoV1 VP2 VLPs诱导细胞免疫反应强度(P<0.001),增强HBoV1 VP2 VLPs诱导的血清Ig G效价(P<0.01)和Ig G活性(P<0.05)。结论:明矾佐剂使HBoV1 VP2 VLPs诱导的体液免疫反应增强而细胞免疫反应减弱。HBoV1 VP2 VLPs作为预防性疫苗使用时应添加明矾佐剂,作为治疗性疫苗使用时应不加明矾佐剂。

RHDV VLPs单克隆抗体的制备及其识别表位的初步定位

为了筛选兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白(VP60)的特异性单抗,并进一步分析单抗识别表位的分布情况,将重组杆状病毒r Ac V-Bac-VP60接种Sf9昆虫细胞,收获细胞培养物,电镜观察显示重组VP60蛋白获得有效表达,并可组装成病毒样粒子(VLPs)。将RHDV VLPs作为免疫原与等量弗氏佐剂乳化,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经3次亚克隆后,获得11株能稳定分泌抗RHDV VLPs抗体的阳性杂交瘤细胞株。间接ELISA、IFA和Western Blot鉴定结果表明,这11株单克隆抗体均能够特异地识别RHDV VLPs和天然RHDV。11株单抗均为Ig G1,其中1D4和3F7的轻链为Lambda型,其余均为Kappa型。截短表达结果显示,单抗5A3针对RHDV VP60的NTA区,5F3针对RHDV VP60的S区,单抗1B8、1D4、3D11、3F7、4C2、4G2、5G2、5H3和6B2针对RHDV VP60的P区。研究为RHDV VLPs抗原表位的鉴定和RHDV结构功能的研究奠定了基础,同时为RHDV的检测和新型疫苗研究提供物质基础。

Her2/ECD-sf162/TM嵌合VLPs的制备及抗肿瘤免疫效果研究

目的:成功制备Her2胞外段基因与猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus,SIV)包膜蛋白sf162跨膜区基因融合的Her2/ECD-sf162/TM病毒样颗粒(VLPs),并在小鼠体内进行初步的抗肿瘤免疫效果研究。方法:利用前期构建好的Her2/neu与SIV-gag嵌合的表达载体Her2/ECD-sf162/TM,制备Her2/neu与SIV-gag嵌合型VLPs疫苗,并用该疫苗免疫小鼠。结果:VLPs可成功激发小鼠体内免疫应答反应,产生血清抗VLPs的抗体;VLP免疫后接种Her2/neu+小鼠乳腺癌细胞EMT6,结果显示该疫苗可有效抑制肿瘤生长;同时,VLP对荷瘤鼠治疗结果也显示,该疫苗可在一定程度上抑制肿瘤生长。结论:VLPs疫苗具有良好的免疫原性,且免疫后对肿瘤攻击具有保护作用。

猪细小病毒病研究进展

猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)是一种无囊膜DNA病毒,主要引起母猪繁殖障碍。该病毒在全世界广泛流行,我国猪场PPV感染率高达90%以上,给养猪业带来巨大经济损失。PPV经口、鼻传播,主要侵染猪的生殖器官,引起母猪的死胎、木乃伊胎和公猪的精液质量下降。临床采用接种疫苗的方式进行防控,起到了一定的效果。论文对病毒的基因组和蛋白特征、流行病学和疫苗研究进行综述,以期为PPV的基础研究和疫苗开发提供参考。

密码子优化的RHDV2双VP60基因重组杆状病毒构建及表达蛋白免疫原性分析

[目的]试验旨在优化兔出血症病毒2型(Rabbit hemorrhagic disease virus 2,RHDV2)病毒样颗粒(virus-like particle, VLP)疫苗的制备策略,探究RHDV2 VLP疫苗对家兔的免疫原性,为低成本、高产量RHDV2新型疫苗研发提供新思路。[方法]根据昆虫细胞的密码子偏好性优化合成RHDV2 VP60全基因,将双VP60基因插入真核载体pFastBacTMDual,转化携带Bacmid质粒的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,构建含双VP60基因的重组杆粒Bacmid-VP60-VP60,转染Sf9昆虫细胞,通过Western blotting、间接免疫荧光试验(IFA)及透射电镜对重组杆状病毒Bacmid-VP60-VP60进行表达验证;将优化策略制备的重组蛋白抗原与氢氧化铝佐剂按照9∶1比例制备VLP灭活疫苗,通过安全性检验、最小免疫剂量、免疫持续期等评估优化策略制备的RHDV2 VLP疫苗的保护效果。[结果]试验成功构建重组杆粒Bacmid-VP60-VP60。Western blotting鉴定结果显示,重组杆状病毒转染Sf9细胞表达出大小约60 ku的RHDV2 VP60蛋白。IFA鉴定结果显示,感染重组杆状病毒的Sf9细胞产生了大量的黄绿色荧光,表明重组杆状病毒在Sf9细胞中大量表达VP60蛋白。透射电镜观察结果显示,VP60蛋白折叠成VLP,大小为40 nm左右,呈现球形结构,表面光滑。优化策略制备的RHDV2 VLP疫苗对家兔具有良好的安全性和免疫原性,最小免疫剂量为0.5 mL/只,免疫持续期可达210 d以上。[结论]试验构建了含有密码子优化的双VP60基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中成功表达RHDV2 VP60蛋白,该蛋白制备的VLP疫苗对家兔具有良好的免疫原性。

基于PAT的PCV2 VLPs生产过程优化与控制研究

昆虫细胞-杆状病毒载体表达系统（baculovirus expression vector system,BEVS）是病毒样颗粒亚单位疫苗（virus like particles,VLPs）的理想生产平台。动物细胞培养过程分析技术（process analytical technology,PAT）研究的重点在于更多地获取与细胞生理状态相关的过程参数,以及实现过程敏感参数的在线表征和过程控制关键时间节点的在线判定,从而指导过程优化和控制。通过昆虫Sf9细胞的分批和补料悬浮培养,发现细胞代谢活性与在线特征频率（fc）之间存在相关性。以fc作为细胞代谢活性的在线指征,在细胞代谢活性下降之前补料,使得Sf9细胞在代谢活性明显增强的基础上,最高活细胞密度提高1.75倍。通过分批培养与补料分批培养过程细胞生理特性参数的相关性分析,发现比电容增长速率（με）与培养体系S-期细胞比例之间存在相关性,με作为细胞增殖活性状态的在线指征参数,可以作为最佳接毒时间的判定依据。此外,研究还发现在线检测参数电容（ε）与最高疫苗产量之间存在相关性,可以作为疫苗最佳收获时间的在线表征参数。以在线fc值作为补料时间指征,以在线με值作为病毒感染时间指征,以在线ε值作为病毒收获时间指征,实现了猪圆环病毒2型（PCV2）VLPs的高效生产。相比于批培养,基于PAT的生产工艺疫苗单位体积产量提高76%,生产周期缩短了24h,为PCV2病毒样颗粒亚单位疫苗大规模生产提供了一种新的高效生产模式。

BVDV-1 VLPs的构建及免疫原性研究

目的利用C、E0、E1和E2蛋白构建BVDV病毒样颗粒,并评价BVDV-1 VLPs的免疫原性。方法以BVDV-BA株为模板通过反转录得到C、E0、E1和E2基因,再将C、E0、E1和E2基因分别克隆至PEASY-Blunt Simple克隆载体上。提取质粒摇菌扩大培养,将得到的C、E0、E1和E2基因克隆至杆状病毒穿梭载体pFast Bac HTA中,采用热激法将重组穿梭质粒转化至DH10.Bac大肠埃希菌感受态细胞,通过蓝白斑筛选技术获得重组杆粒rB-C、rB-E0、rB-E1和rB-E2。将重组杆粒转染至SF9细胞,获得重组杆状病毒;再用构建的4种重组杆状病毒同时感染SF9悬浮细胞,72 h后收集细胞沉淀进行超声破碎,利用蔗糖垫超速离心和蔗糖密度梯度离心进行纯化,通过Western blot和透射电镜进行鉴定。将获得的BVDV-1 VLPs联合氢氧化铝佐剂免疫BALB/c小鼠,通过ELISA检测免疫小鼠的特异性抗体水平评价VLPs的免疫原性。结果成功克隆出C、E0、E1和E2基因,并构建C、E0、E1和E2蛋白的杆状病毒。通过纯化和鉴定,在20%~30%蔗糖层获得由C、E0、E1和E2蛋白组成结构完整的病毒样颗粒BVDV-1 VLPs。BVDV-1 VLPs能够显著增加免疫小鼠的特异性抗体表达水平。结论构建并获得了由C、E0、E1和E2蛋白组成,并具备良好免疫原性的病毒样颗粒BVDV-1 VLPs。

动物RNA病毒VLPs疫苗的研究进展

RNA病毒引发了众多的人类、动物重大疫病和公共卫生事件,然而目前尚无针对RNA病毒的特效药物,开发安全且有效的疫苗是控制RNA病毒感染的最有效手段,新型疫苗研发和使用已经是第3次疫苗革命的主题。病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)是病毒的一种或几种结构蛋白构成的纳米级空心颗粒,不含有感染性遗传物质,无法自我复制,具有较高安全性。另外,VLPs形态结构与天然病毒粒子类似,保留了天然病毒粒子的空间构象,易被宿主免疫系统有效的识别、摄取和递呈,进而高效地诱导T细胞和B细胞的免疫反应,是近年来新型疫苗领域中的研究热点。现对RNA病毒结构与功能、VLPs疫苗的分类、包装与嵌入、表达系统及载体动能、免疫原性评价、蛋白定量及纯化等方面进行综述。

犬细小病毒VP2蛋白特点及病毒样颗粒疫苗制备研究进展

犬细小病毒病危害犬的健康,传统疫苗不能有效保护犬免受病毒的侵扰,寻求新的疫苗是当前研究和关注的热点。VP2蛋白是犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)的主要保护性抗原蛋白,在决定宿主范围和入侵过程中起重要作用。此外,VP2蛋白在N-端结构域和环结构域中含有几个重要的B细胞表位,可在CPV感染过程中诱导产生有效的中和抗体。因此,在开发CPV基因组亚单位疫苗中,VP2蛋白可作为候选抗原的首选。病毒样颗粒(VLPs)与天然病毒相似,但不具备天然病毒的复制功能引起机体发生感染,故近几年来利用不同的表达系统组装VP2蛋白一直是研究者们研究的重点。笔者着重对CPV VP2蛋白的特点及构象进行分析,通过特点分析得知CPV衣壳的主要成分中含有VP2,不但具有血凝活性,还与CPV的宿主范围和抗原性密切相关,因此,有活性的VP2蛋白在CPV基因工程亚单位疫苗的开发中极其重要。通过构象分析得知CPV VP2蛋白环状结构(Flexible loop)具有更大的灵活性,这可能是CPV感染宿主范围不断扩大的分子基础。同时笔者对VLPs疫苗的制备方法及优缺点进行讨论,以期为CPV疫苗的研究制备提供有利的参考和科学依据。

体外组装的病毒样颗粒在疫苗和药物递送中的应用

病毒样颗粒(virus like particles,VLPs)近年来被广泛应用于疫苗和治疗性药物递送系统领域。与体内组装VLPs相比,体外组装VLPs具有组装寡聚体成分明确、反应条件可控、避免宿主成分的引入以及能实现药物活性成分的包裹和递送功能等诸多优势。概述了体外VLPs的生产方法、影响体外VLPs形成的因素、VLPs的特征分析方法,综述了体外VLPs在疫苗和治疗性药物递送方面的应用进展,期望对体外VLPs组装技术的发展提供参考思路,促进体外VLPs组装技术在疾病预防和治疗应用方面发挥更大的作用。

病毒样颗粒及其疫苗研究

随着传统疫苗的升级换代,疫苗的研制越来越多的借助于基因工程手段,其中病毒样颗粒(VLPs)成为了当今病毒性疫苗研究的热点,尤其对于不易在体外大规模培养的病毒,VLPs是研发其疫苗的突破口。关于VLPs及其疫苗的研究,从球状病毒的组装理论、病毒的VLPs组装、VLP疫苗设计和VLP疫苗等几个方面予以综述。

猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化及鉴定

为获得较高纯度的猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)Cap蛋白的病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)并对其进行结构和功能研究,本试验以大肠杆菌表达系统表达了PCV2重组Cap(PCV2 rCap)蛋白,通过硫酸铵分级沉淀、Sephacryl S-300 HR凝胶过滤层析、Capto Q离子交换层析、CsCl密度梯度离心等方法对其进行了纯化。通过Western blotting对纯化所得蛋白进行免疫反应性鉴定,透射电镜(TEM)观察纯化蛋白的粒径及形态,高效液相尺寸排阻色谱(HPSEC)检测其组分分布。结果显示,纯化后PCV2 rCap蛋白经SDS-PAGE检测,可见28 ku的目的蛋白带,灰度扫描法检测其纯度为97.53%。Western blotting结果显示,该处的特异性蛋白条带有明显的免疫反应性;TEM检测其为粒径17.35~19.24 nm的规则球形颗粒,表明所获得的PCV2 rCap蛋白在表达时能在菌体内自我装配成VLPs,且在纯化过程中没有被破坏而解聚,仍保持天然状态;HPSEC检测纯化样品中VLPs含量为92.67%。本试验结果为进一步研究PCV2 VLPs的空间结构及其免疫保护机制提供了参考依据。

基于阵列传感器的可见光室内定位系统研究

为了改进接收端阵列传感器测量装置以及AOA数据处理算法,提高定位所需角度信息测量的准确性,文章通过设计传感器阵列交叉排列,增加不同俯仰角个数,从而提高测量精度。基于角度信息测量校准实验,文章采用相似度算法计算俯仰角,设计系统定位性能实验,在2 m^(2)的室内场景下对112个点进行定位实验,将相似度算法用于AOA俯仰角数据处理后,定位平均误差由14.59 cm降至5.58 cm。综上,采用相似度算法处理数据能够提高俯仰角测量精度,为进一步研究奠定基础。

HPV58型衣壳蛋白L1和L2基因的克隆表达及病毒样颗粒的装配

目的大量表达和纯化HPV58衣壳蛋白,形成病毒相似颗粒。方法制备携带HPV58L1和L2基因的重组杆状病毒,转染昆虫细胞,在真核细胞中大量表达HPV58L1和L2蛋白并进行纯化。电镜观察病毒相似颗粒的形成情况。免疫小鼠制备特异性抗血清。结果 HPV58L1和L2蛋白在真核细胞中被高效表达,电镜下见表达纯化的病毒衣壳蛋白L1与L2共同组装形成病毒相似颗粒(VLPs),用其免疫小鼠能产生针对HPV58L1蛋白的高滴度的特异性抗体。结论在真核细胞中大量表达HPV58L1和L2蛋白,纯化后能形成病毒相似颗粒,并具备很强的免疫原性,有望用其制作宫颈癌预防性疫苗。

C6／36浓核病毒样颗粒在大肠杆菌中的表达与组装

通过PCR获得C6/36细胞浓核病毒(C6/36DNV)的结构蛋白VP1和VP2的基因,经克隆表达,在大肠杆菌中得到了含6×His标签的VP1或VP2的融合蛋白表达产物;两种表达产物经超速离心纯化后,在电镜下均观察到了大小(约25 nm)和形态都与野生C6/36DNV相似的病毒样颗粒(VLPs),且两种VLPs(VP1-VLPs和VP2-VLPs)在电镜下未见有明显差别,说明VP1和VP2在大肠杆菌中表达后均可独立组装成VLPs.

人乳头瘤病毒(HPV)与宫颈癌及其疫苗作用的探讨

目的:探讨HPV与宫颈癌及其疫苗的作用。方法:对200多名女性随访研究并为其注射VLPs疫苗。结果:99.7%的女性体内产生保护性抗体。结论:VLPs疫苗可能会减少宫颈癌的发生。

猪圆环病毒2型抗体胶体金免疫层析检测方法的建立

为建立便捷、快速检测猪圆环病毒2型(PCV2)抗体的免疫层析方法,本研究利用G蛋白标记胶体金制备金标垫,以PCV2病毒样颗粒(VLPs)和兔Ig G分别作为检测线与质控线组装胶体金试纸条。检测结果显示,该试纸条与A型塞内卡病毒(SVA)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)等猪其它病毒抗体阳性血清无交叉反应,仅对PCV2抗体阳性血清具有高度的特异性;对PCV 2阳性血清最低检测限为1∶6 400稀释度,敏感性较高;批内、批间变异系数CV均小于5%,重复性较好。试纸条在4℃保存6个月,其特异性和敏感性无明显变化。对采集的100份临床血清样品进行检测,该方法与标准ELISA的总符合率为98%。表明本研究建立的PCV2抗体的胶体金免疫层析检测方法具有敏感、特异、稳定等特点,可以做为评价PCV2疫苗免疫效果及其感染筛查的检测方法。