猪细小病毒病研究进展

猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)是一种无囊膜DNA病毒,主要引起母猪繁殖障碍。该病毒在全世界广泛流行,我国猪场PPV感染率高达90%以上,给养猪业带来巨大经济损失。PPV经口、鼻传播,主要侵染猪的生殖器官,引起母猪的死胎、木乃伊胎和公猪的精液质量下降。临床采用接种疫苗的方式进行防控,起到了一定的效果。论文对病毒的基因组和蛋白特征、流行病学和疫苗研究进行综述,以期为PPV的基础研究和疫苗开发提供参考。

密码子优化的RHDV2双VP60基因重组杆状病毒构建及表达蛋白免疫原性分析

[目的]试验旨在优化兔出血症病毒2型(Rabbit hemorrhagic disease virus 2,RHDV2)病毒样颗粒(virus-like particle, VLP)疫苗的制备策略,探究RHDV2 VLP疫苗对家兔的免疫原性,为低成本、高产量RHDV2新型疫苗研发提供新思路。[方法]根据昆虫细胞的密码子偏好性优化合成RHDV2 VP60全基因,将双VP60基因插入真核载体pFastBacTMDual,转化携带Bacmid质粒的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,构建含双VP60基因的重组杆粒Bacmid-VP60-VP60,转染Sf9昆虫细胞,通过Western blotting、间接免疫荧光试验(IFA)及透射电镜对重组杆状病毒Bacmid-VP60-VP60进行表达验证;将优化策略制备的重组蛋白抗原与氢氧化铝佐剂按照9∶1比例制备VLP灭活疫苗,通过安全性检验、最小免疫剂量、免疫持续期等评估优化策略制备的RHDV2 VLP疫苗的保护效果。[结果]试验成功构建重组杆粒Bacmid-VP60-VP60。Western blotting鉴定结果显示,重组杆状病毒转染Sf9细胞表达出大小约60 ku的RHDV2 VP60蛋白。IFA鉴定结果显示,感染重组杆状病毒的Sf9细胞产生了大量的黄绿色荧光,表明重组杆状病毒在Sf9细胞中大量表达VP60蛋白。透射电镜观察结果显示,VP60蛋白折叠成VLP,大小为40 nm左右,呈现球形结构,表面光滑。优化策略制备的RHDV2 VLP疫苗对家兔具有良好的安全性和免疫原性,最小免疫剂量为0.5 mL/只,免疫持续期可达210 d以上。[结论]试验构建了含有密码子优化的双VP60基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中成功表达RHDV2 VP60蛋白,该蛋白制备的VLP疫苗对家兔具有良好的免疫原性。

铝佐剂对HBoV1 VP2 VLPs诱导小鼠免疫应答的影响

目的:探讨铝佐剂对HBoV1 VP2 VLPs诱导小鼠免疫应答的影响。方法:BABL/c小鼠随机分为VLPs实验组、明矾佐剂实验组、PBS对照组和明矾佐剂对照组。实验组小鼠分别采用HBoV1 VP2 VLPs和HBoV1 VP2 VLPs加明矾佐剂肌肉注射免疫,对照组小鼠同期注射等量明矾佐剂或PBS缓冲液;实验8周后ELISA检测两实验组特异性Ig G抗体效价和活性,ELIspot检测两实验组特异性细胞免疫反应强度,从细胞免疫和体液免疫强度探讨铝佐剂对HBoV1 VP2 VLPs诱导小鼠免疫应答的影响。结果:明矾佐剂降低HBoV1 VP2 VLPs诱导细胞免疫反应强度(P<0.001),增强HBoV1 VP2 VLPs诱导的血清Ig G效价(P<0.01)和Ig G活性(P<0.05)。结论:明矾佐剂使HBoV1 VP2 VLPs诱导的体液免疫反应增强而细胞免疫反应减弱。HBoV1 VP2 VLPs作为预防性疫苗使用时应添加明矾佐剂,作为治疗性疫苗使用时应不加明矾佐剂。

RHDV VLPs单克隆抗体的制备及其识别表位的初步定位

为了筛选兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白(VP60)的特异性单抗,并进一步分析单抗识别表位的分布情况,将重组杆状病毒r Ac V-Bac-VP60接种Sf9昆虫细胞,收获细胞培养物,电镜观察显示重组VP60蛋白获得有效表达,并可组装成病毒样粒子(VLPs)。将RHDV VLPs作为免疫原与等量弗氏佐剂乳化,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经3次亚克隆后,获得11株能稳定分泌抗RHDV VLPs抗体的阳性杂交瘤细胞株。间接ELISA、IFA和Western Blot鉴定结果表明,这11株单克隆抗体均能够特异地识别RHDV VLPs和天然RHDV。11株单抗均为Ig G1,其中1D4和3F7的轻链为Lambda型,其余均为Kappa型。截短表达结果显示,单抗5A3针对RHDV VP60的NTA区,5F3针对RHDV VP60的S区,单抗1B8、1D4、3D11、3F7、4C2、4G2、5G2、5H3和6B2针对RHDV VP60的P区。研究为RHDV VLPs抗原表位的鉴定和RHDV结构功能的研究奠定了基础,同时为RHDV的检测和新型疫苗研究提供物质基础。

Her2/ECD-sf162/TM嵌合VLPs的制备及抗肿瘤免疫效果研究

目的:成功制备Her2胞外段基因与猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus,SIV)包膜蛋白sf162跨膜区基因融合的Her2/ECD-sf162/TM病毒样颗粒(VLPs),并在小鼠体内进行初步的抗肿瘤免疫效果研究。方法:利用前期构建好的Her2/neu与SIV-gag嵌合的表达载体Her2/ECD-sf162/TM,制备Her2/neu与SIV-gag嵌合型VLPs疫苗,并用该疫苗免疫小鼠。结果:VLPs可成功激发小鼠体内免疫应答反应,产生血清抗VLPs的抗体;VLP免疫后接种Her2/neu+小鼠乳腺癌细胞EMT6,结果显示该疫苗可有效抑制肿瘤生长;同时,VLP对荷瘤鼠治疗结果也显示,该疫苗可在一定程度上抑制肿瘤生长。结论:VLPs疫苗具有良好的免疫原性,且免疫后对肿瘤攻击具有保护作用。

Toward innovative veterinary nanoparticle vaccines

Nanoparticles are significant for veterinary vaccine development because they are safer and more effective than conventional formulations.One promising area of research involves self-assembled protein nanoparticles(SAPNs),which have shown potential for enhancing antigen-presenting cell uptake,B-cell activation,and lymph node trafficking.Numerous nanovaccines have been utilized in veterinary medicine,including natural self-assembled protein nanoparticles,rationally designed self-assembled protein nanoparticles,animal virus-derived nanoparticles,bacteriophagederived nanoparticles,and plant-derived nanoparticles,which will be discussed in this review.SAPN vaccines can produce robust cellular and humoral immune responses and have been shown to protect against various animal infectious diseases.This article attempts to summarize these diverse nanovaccine types and their recent research progress in the field of veterinary medicine.Furthermore,this paper highlights their disadvantages and methods for improving their immunogenicity.

加热法促进猪圆环病毒2型病毒样颗粒的高效组装

为了提高猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳(Cap)蛋白病毒样颗粒(VLPs)的产量,本试验探索了采用加热法促进杆状病毒-昆虫细胞表达的Cap蛋白体外组装的可行性,通过高效液相尺寸排阻色谱法定量PCV2 Cap VLPs,分析4~56℃加热0~10 h对细胞培养液上清中PCV2 Cap VLPs浓度的影响,并采用透射电子显微镜(TEM)验证;通过监测45℃加热6 h后的细胞培养液上清在4℃放置6个月中PCV2 Cap VLPs的浓度变化,验证PCV2 Cap VLPs的稳定性;通过全能核酸酶消化试验验证宿主核酸对PCV2 Cap VLPs组装的作用;对比加热与未加热工艺的PCV2 Cap VLPs纯化收率,并通过高效液相尺寸排阻色谱偶联多角度激光散射、圆二色光谱、差示扫描量热法和微量热泳动分析2种工艺所得PCV2 Cap VLPs表征的一致性。结果显示,细胞培养液上清中PCV2 Cap VLPs浓度随着温度和时间的延长逐渐升高,其中45℃加热6 h后PCV2 Cap VLPs浓度为未加热的3.77倍,TEM观察进一步验证PCV2 Cap VLPs浓度增加。加热后形成的PCV2 Cap VLPs在4℃储存6个月浓度稳定,未出现解聚现象。全能核酸酶消化试验显示,加热过程中宿主核酸的作用并非关键因素。采用45℃加热6 h后再进行纯化,PCV2 Cap VLPs纯化收率是未加热工艺的2.9倍。经分析,加热与未加热工艺所得PCV2 Cap VLPs具有一致的分子量(2.385×10^(6)和2.361×10^(6) Da)、水力学半径(10.1和10.2 nm)、热转变温度Tm(67.22和66.92℃)、二级结构和特异性抗体亲和力(49.0和76.5 pmol/L),表明两者具有相近结构。本试验为PCV2 Cap VLPs的生产探索了一个提高产量的新方法,为兽用疫苗的研发提供了在抗原性质分析方法上的借鉴。

病毒样颗粒疫苗研究进展

病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)是含有某种病毒一个或多个结构蛋白的空心颗粒形态,结构上类似完整病毒,具有与完整病毒相似的免疫原性并通过激活抗原提呈细胞诱导免疫应答,由于不含有完整的病毒基因组,因此适合用于开发更安全、成本更低的候选疫苗。系统阐述了VLPs的分类、表征、优势及表达系统,回顾了VLPs疫苗的发展历程,并汇总了已上市的疫苗品种。同时,介绍了部分在研的预防性或治疗性VLPs疫苗,并探讨了新的开发策略,进一步拓宽了VLPs疫苗的研发领域,为未来的研究与应用提供了更广阔的前景。

猪口蹄疫O型病毒样颗粒疫苗田间试验报告

猪口蹄疫O型病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)疫苗是一种基于病毒颗粒表面抗原的疫苗,通过模拟病毒颗粒的结构和表面蛋白,刺激机体产生特异性免疫反应,从而达到预防猪口蹄疫的目的。本试验主要探讨猪口蹄疫O型VLPs疫苗接种后的免疫反应及抗体测定,为猪口蹄疫O型VLPs疫苗的优化和应用提供科学依据。试验表明,试验A组免疫2次,第60d猪口蹄疫O型抗体阳性率100%,口蹄疫3ABC抗体阳性率0%;试验B组免疫1次,第0d、15d、30 d、60d、90d、120d、150d、165d猪口蹄疫O型抗体阳性率分别为0%、77.1%、85.4%、82.6%、86.7%、80%、85.7%、80%,达到国家免疫合格率的目标要求,口蹄疫3ABC抗体阳性率0%。

犬细小病毒VP2蛋白特点及病毒样颗粒疫苗制备研究进展

犬细小病毒病危害犬的健康,传统疫苗不能有效保护犬免受病毒的侵扰,寻求新的疫苗是当前研究和关注的热点。VP2蛋白是犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)的主要保护性抗原蛋白,在决定宿主范围和入侵过程中起重要作用。此外,VP2蛋白在N-端结构域和环结构域中含有几个重要的B细胞表位,可在CPV感染过程中诱导产生有效的中和抗体。因此,在开发CPV基因组亚单位疫苗中,VP2蛋白可作为候选抗原的首选。病毒样颗粒(VLPs)与天然病毒相似,但不具备天然病毒的复制功能引起机体发生感染,故近几年来利用不同的表达系统组装VP2蛋白一直是研究者们研究的重点。笔者着重对CPV VP2蛋白的特点及构象进行分析,通过特点分析得知CPV衣壳的主要成分中含有VP2,不但具有血凝活性,还与CPV的宿主范围和抗原性密切相关,因此,有活性的VP2蛋白在CPV基因工程亚单位疫苗的开发中极其重要。通过构象分析得知CPV VP2蛋白环状结构(Flexible loop)具有更大的灵活性,这可能是CPV感染宿主范围不断扩大的分子基础。同时笔者对VLPs疫苗的制备方法及优缺点进行讨论,以期为CPV疫苗的研究制备提供有利的参考和科学依据。

体外组装的病毒样颗粒在疫苗和药物递送中的应用

病毒样颗粒(virus like particles,VLPs)近年来被广泛应用于疫苗和治疗性药物递送系统领域。与体内组装VLPs相比,体外组装VLPs具有组装寡聚体成分明确、反应条件可控、避免宿主成分的引入以及能实现药物活性成分的包裹和递送功能等诸多优势。概述了体外VLPs的生产方法、影响体外VLPs形成的因素、VLPs的特征分析方法,综述了体外VLPs在疫苗和治疗性药物递送方面的应用进展,期望对体外VLPs组装技术的发展提供参考思路,促进体外VLPs组装技术在疾病预防和治疗应用方面发挥更大的作用。

基于阵列传感器的可见光室内定位系统研究

为了改进接收端阵列传感器测量装置以及AOA数据处理算法,提高定位所需角度信息测量的准确性,文章通过设计传感器阵列交叉排列,增加不同俯仰角个数,从而提高测量精度。基于角度信息测量校准实验,文章采用相似度算法计算俯仰角,设计系统定位性能实验,在2 m^(2)的室内场景下对112个点进行定位实验,将相似度算法用于AOA俯仰角数据处理后,定位平均误差由14.59 cm降至5.58 cm。综上,采用相似度算法处理数据能够提高俯仰角测量精度,为进一步研究奠定基础。

猪细小病毒病毒样颗粒疫苗研究进展

猪细小病毒(PPV)感染可导致母猪繁殖障碍、断奶仔猪多系统衰弱综合征和肠炎性腹泻等疾病,给养猪业造成巨大的经济损失。临床防控以接种疫苗为主,常用的疫苗有弱毒疫苗和灭活疫苗。随着生物技术的发展,新型PPV疫苗的研究工作成绩显著。VP2蛋白是PPV主要的衣壳蛋白,对研究新型PPV疫苗至关重要,综述了猪细小病毒VP2蛋白及病毒样颗粒疫苗的研究进展,以期为新型PPV疫苗的研究提供参考。

葡萄多糖抑菌特性的研究

用葡萄多糖 (VLP)对 8种常见食品微生物进行抑菌实验 ,结果表明 ,葡萄多糖对枯草芽孢杆菌、根霉、酿酒酵母菌有显著的抑制作用 ,最小抑制浓度分别为 :枯草芽孢杆菌为 12 5 μg/mL ,大肠杆菌为 2 5 μg/mL ,金黄色葡萄球菌为 5 0 μg/mL ,根霉为 2 5 μg/mL ,曲霉为 5 0 μg/mL ,酿酒酵母菌为 2 5 μg/mL。葡萄多糖抑菌存在最佳 pH值 ,温度越高 ,抑菌效果越显著。相同时间内 ,多糖溶液浓度越高 ,抑菌率越高 ;同一浓度 ,作用时间越长 ,抑菌率越高。

猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化及鉴定

为获得较高纯度的猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)Cap蛋白的病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)并对其进行结构和功能研究,本试验以大肠杆菌表达系统表达了PCV2重组Cap(PCV2 rCap)蛋白,通过硫酸铵分级沉淀、Sephacryl S-300 HR凝胶过滤层析、Capto Q离子交换层析、CsCl密度梯度离心等方法对其进行了纯化。通过Western blotting对纯化所得蛋白进行免疫反应性鉴定,透射电镜(TEM)观察纯化蛋白的粒径及形态,高效液相尺寸排阻色谱(HPSEC)检测其组分分布。结果显示,纯化后PCV2 rCap蛋白经SDS-PAGE检测,可见28 ku的目的蛋白带,灰度扫描法检测其纯度为97.53%。Western blotting结果显示,该处的特异性蛋白条带有明显的免疫反应性;TEM检测其为粒径17.35~19.24 nm的规则球形颗粒,表明所获得的PCV2 rCap蛋白在表达时能在菌体内自我装配成VLPs,且在纯化过程中没有被破坏而解聚,仍保持天然状态;HPSEC检测纯化样品中VLPs含量为92.67%。本试验结果为进一步研究PCV2 VLPs的空间结构及其免疫保护机制提供了参考依据。

HepG2细胞中与戊型肝炎病毒衣壳蛋白相互作用蛋白的初步研究

利用重组戊型肝炎病毒（HEV）衣壳蛋白片段p239（368～606aa）形成的类病毒颗粒作为亲和层析诱饵蛋白，HepG2为细胞模型，筛选与p239类病毒颗粒特异性相互作用蛋白：经过二维电泳分离，MALDI-TOF-MS分析鉴定得到GRP78／Bip，HSP90，alpha-tubulin及P43四个与p239有相互作用的候选蛋白。GRP78／Bip为热休克蛋白家族成员，体外免疫共沉淀实验结果证实，其与p239有特异性的结合：此研究结果为深入研究HEV的感染过程如吸附、入胞，以及HEV的致病机理提供了有益线索。