人疱疹病毒8编码的趋化因子vMIP-II在大肠杆菌的优化表达

目的:探讨优化vMIP-II/MBP融合蛋白表达载体pMal在原核细胞中的表达条件,并对其表达产物进行纯化。方法:通过接菌、诱导表达,实验了解诱导时不同的温度、诱导时间、IPTG浓度对蛋白表达量的影响,并进行SDS-聚丙烯酰氨凝胶(SDS-PAGE)电泳分析。结果:发现该菌在含0 3mmol/LIPTG的TB培养基中,28℃诱导表达4h,可使诱导蛋白表达量占菌体蛋白总量的10%。结论:vMIP-Ⅱ/MBP的表达受温度条件影响较大,低温诱导时表达水平较高。从而为该工程菌的中试提供了实验基础。

vMIP-II对细胞表面趋化因子受体CXCR4内化及调变的研究

研究利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪分别定性、定量检测CXCR4的内化,观察vMIP-II对细胞表面趋化因子受体CXCR4内化的影响,用荧光分光光度计连续动态检测vMIP-II对细胞内钙离子浓度的影响,以阐明vMIP-II抗HIV/AIDS的作用机制。结果表明100 ng/ml vMIP-II在给药后的最初30 min能使细胞表面受体CXCR4内化达到最大值,内化率约为75%,且内化到细胞内的CXCR4并不能再循环到细胞表面。vMIP-II能诱导瞬间的高钙离子内流及细胞内钙离子库中钙离子的释放,证明了vMIP-II能引起细胞表面受体CXCR4的内化,内化的受体不再循环到细胞表面。

Pep-1-vMIP-Ⅱ对小鼠抗HIV-Ⅰ基因表达的作用

目的探讨融合蛋白Pep-1-vMIP-Ⅱ在影响宿主ARGs基因表达抵抗HIV-Ⅰ感染中的作用。方法小鼠背部涂抹Pep-1-vMIP-Ⅱ2 h后,用免疫组织化学方法测定不同组织器官中vMIP-Ⅱ的穿膜情况。用实时定量PCR,检测24 h后不同组织器官中ARGs mRNA表达水平;用Graphpad Prism 5软件分析实验数据。结果皮肤涂抹Pep-1-vMIP-Ⅱ组2 h后vMIP-Ⅱ在肾脏分布明显增加(P<0.05);涂抹Pep1-vMIP-Ⅱ24 h后,白细胞、肾、心、肝和肺中CCL5的mRNA表达水平有明显差异(P<0.05),脑组织中CCL5的表达未见明显增加;MX1、MX2在多种组织中都表达上调(P<0.05)。结论Pep-1-vMIP-Ⅱ可以穿透小鼠皮肤进入肾脏组织,主要通过激活CCL5基因表达发挥调控作用。

vMIP-Ⅱ-TfN融合蛋白在毕赤酵母中的表达和纯化

目的:构建pPIC-vMIP-II-TfN酵母表达载体,表达纯化vMIP-II-TfN融合蛋白。方法:利用PCR方法扩增编码人转铁蛋白N端半分子的基因片段,通过酶切、连接、转化等分子克隆方法构建pPIC-vMIP-II-TfN酵母表达载体;电击法转化X33酵母菌;用甲醇诱导重组酵母菌表达融合蛋白,利用硫酸铵沉淀、透析、Ni-NTA层析等技术进行蛋白纯化,SDS-PAGE和Western blot检测蛋白表达和纯化情况,利用趋化实验进行纯化蛋白活性检测。结果:经过两次PCR扩增了一个长约1.1kb的包含Xba I酶切位点的IgG3-TfN基因片段,插入pPIC-vMIP-II的Xba I酶切位点,经菌液PCR鉴定获得重组子,测序结果表明构建载体pPIC-vMIP-II-TfN的表达框正确无误,转化X33酵母菌,用甲醇诱导表达出48kDa的vMIP-II-TfN融合蛋白,经硫酸铵沉淀、透析、Ni-NTA纯化后得到纯度约为95%的vMIP-II-TfN融合蛋白。Western印迹结果表明融合蛋白能与转铁蛋白抗体特异性结合。活性检测表明经过诱导表达的vMIP-II-TfN融合蛋白具有趋化抑制活性。结论:成功构建pPIC-vMIP-II-TfN酵母表达载体,重组酵母工程菌经甲醇诱导成功表达出vMIP-II-TfN融合蛋白,纯化后的vMIP-II-TfN融合蛋白具有趋化抑制活性。