鱼类病毒(SVCV、CyHV-3、CEV和VNNV)LAMP联检方法的建立和应用

建立鲤春病毒血症病毒(SVCV)、鲤疱疹病毒3(CyHV-3)、鲤鱼浮肿病毒(CEV)和病毒性神经坏死病病毒(VNNV)等4种鱼类常见病毒的环介导等温扩增技术(LAMP)联合检测方法。基于4种鱼类病毒的基因保守区分别设计LAMP引物组,优化反应体系和条件,筛选测试出特异性和灵敏度最佳的引物组,建立4种鱼类常见病毒的联合检测LAMP方法,同时以市售的荧光定量检测试剂盒测试结果作为对照,评估建立的联合检测LAMP方法的准确性。结果显示,筛选出的SVCV、CyHV-3、CEV和VNNV的LAMP引物组特异性均良好,优化后的体系反应条件均为63℃,60 min,其中SVCV和CyHV-3均可检测到10 fg/μL,CEV和VNNV可检测到1 fg/μL。应用建立的4种病毒联合LAMP检测方法和市售的各荧光定量PCR检测试剂盒对150份收集的组织样本进行平行测试,联合LAMP检测方法的准确率为100%。建立的鱼类病毒LAMP联检方法能够准确、高效、快速地在鱼类组织样本中同时对SVCV、CyHV-3、CEV和VNNV进行检测,适合水产养殖现场检测,对病毒的监测和快速诊疗起到重要作用。

鱼病毒性神经坏死病病毒(VNNV)不同基因型鉴别方法的建立及在VNN检疫和监测中的应用

从GenBank中查找出乙型野田村病毒组中海水鱼类各病毒的序列,并用Sequencher多重序列比较软件将其分到条纹神经坏死病毒(stripedjacknervousnecrosisvirus,SJNNV)组、条纹星鲽神经坏死病毒(barfinfloundernervousnecrosisvirus,BFNNV)组、红点石斑鱼神经坏死病毒(redspottedgroupernervousnecrosisvirus,RGNNV)组和虎斑东方神经坏死病毒(tigerpuffernervousnecrosisvirus,TPNNV)组4个基因型的组别中。用DNAsis序列比较软件比较同一基因型各基因序列之间的同源性,均在85%以上;不同基因型之间序列的同源性,均在66%以下。结合Premier引物设计软件和Sequencher序列多重比较软件,设计了4对引物,采用逆转录聚合酶链式反应(RT PCR)来鉴别这4个不同的基因型。对从深圳口岸进境的产地为台湾的海水鱼苗和广东、福建两省养殖的主要海水鱼类进行检疫和监测,结果在进境的海水鱼苗中检出有RGNNV基因型的VNNV,在福建和广东省养殖的石斑鱼成鱼和鱼苗的病鱼体内均检测到RGNNV基因型的VNNV,对上述扩增产物基因序列进行比较,相似性均在96.5%以上,推导出的氨基酸序列与玛拉巴石斑鱼神经坏死病毒(MNNV)序列相似性均为100%。