2013-2019年柳州市手足口病病原学监测结果及肠道病毒71型VP1基因特征分析

目的 分析2013-2019年柳州市手足口病病原学监测结果,掌握该地区手足口病的病原组成以及肠道病毒71型(EV71)的分子流行病学特征,为当地手足口病的防控提供科学依据。方法 采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RTPCR)对收集的手足口病病例标本进行病原学检测。对重症或死亡病例的病原进行分型检测,选取2017年的5例EV71阳性手足口病重症或死亡病例标本进行VP1基因序列测定和特征分析。结果 2013-2019年柳州市共检测6 038例手足口病病例标本,肠道病毒通用型阳性标本4 210例(69.73%),其中EV71阳性659例(15.65%)、柯萨奇病毒A16型(Cox A16)阳性1 159例(27.53%)、其他肠道病毒阳性2 392例(56.82%)。2013年、2015年、2017年、2019年以其他肠道病毒为主(阳性率均>50.00%),2014年以EV71和其他肠道病毒为主,2016年、2018年以Cox A16和其他肠道病毒为主。2014-2019年重症或死亡病例的病原学分型显示,重症或死亡病例的主要病原是EV71、Cox A16、柯萨奇病毒A6型(Cox A6)、柯萨奇病毒A2型(Cox A2)。2017年该市手足口病重症或死亡病例中分离到的5株EV71毒株的病原基因亚型均为C4a亚型,毒株序列之间的核苷酸同源性为95.20%~100.00%,氨基酸同源性为97.50%~100.00%。结论 2013-2019年柳州市手足口病的优势病原发生了变化,主要病原由EV71逐渐转变为Cox A16和其他肠道病毒。引发重症或死亡病例的病原主要有EV71、Cox A16、Cox A6、Cox A2,EV71的优势基因型为C4a亚型。今后应进一步加强病原监测和相关分子流行病学研究,为落实手足口病综合性防控措施提供依据。

鸡群中鸡传染性贫血病原与抗体检测及分离株VP1基因序列分析

为了解鸡群中鸡传染性贫血病毒(CAV)感染及抗体产生情况,从黑龙江省两个无临床症状鸡群(B群和S群)中,分别采集血清通过ELISA方法进行抗体检测,采集抗凝血并分离淋巴细胞,针对基因组保守序列设计引物,通过PCR方法进行病原检测,并对从B群病原阳性鸡分离到的分离株进行VP1基因序列分析。结果显示,B群和S群CAV抗体阳性率分别为62.7%(79/126)和68.2%(88/129),病原阳性率分别为43.0%(49/114)和62.3%(48/77),其中,B群和S群中抗体和病原双阴性的鸡分别为23.7%(27/114)和15.6%(12/77),而抗体和病原双阳性的鸡分别高达28.1%(32/114)和46.8%(36/77);在双阳性鸡中,B群和S群分别有62.5%(20/32)和58.3%(21/36)抗体滴度在1.0×10^(4)及以上,从B群病原阳性鸡全血中分离到一株CAV(HLJ/2022株),分离株HLJ/2022第394位氨基酸为谷氨酰胺,具有强毒的分子特征;两个鸡群的环境拭子CAV阳性率为10.0%(3/30),存在于消毒前的鸡蛋表面、更衣处和鞋底。研究表明,检测鸡群的CAV抗体阳性率在62.7%以上,病原阳性率在43.0%以上,抗体滴度在1.0×104及以上CAV仍可存在,CAV流行株(HLJ/2022)具有强毒分子特征,鸡群环境中存在CAV污染,结果为CIA防控提供重要的参考意见。

2020—2023年山东地区13株3型鸭甲型肝炎病毒的分离鉴定及VP1基因序列分析

为研究2020—2023年山东地区3型鸭甲型肝炎病毒的流行变异情况,试验采集了山东地区13份疑似鸭肝炎病毒感染的病料,通过病毒分离、RT-PCR扩增鉴定,并进行VP1基因测序及遗传变异分析。结果显示:共分离到13株3型鸭甲型肝炎病毒,均属于GⅠa分支,且分属于GⅠa分支不同小分支,其中2020年分离株(20148、20149)与2021年商品肉鸭分离株(SP21042)核苷酸相似性在98.8%~100%;2023年商品鸭分离株(SP23012、SP23014、SP-2、SP-3、SP23009)核苷酸相似性在99.7%~100%;2021年种鸭分离株(21083)与2022年、2023年种鸭分离株(22443、22468、BL23028)、2023年商品鸭分离株(SP23010)核苷酸相似性在98.8%~99.4%,小分支内相似性均高于98.8%,不同小分支间相似性在96.9%~98.2%;2023年部分3型DHAV分离株VP1基因出现了个别氨基酸位点的突变。研究表明,山东地区分离的13株GⅠa分支鸭甲型肝炎病毒VP1基因出现了变异,需要加以关注。

猪萨佩罗病毒HNHB-01株VP1基因的表达与分子特征

猪萨佩罗病毒(PSV)VP1蛋白是位于病毒粒子表面的结构蛋白,发挥主要的抗原效应。为了弄清PSV HNHB-01株VP1基因的表达与分子特征,本研究设计针对VP1基因的特异性引物,通过RT-PCR扩增获得VP1基因,并重组到真核表达载体pCAGGS上,经Western blot、间接免疫荧光鉴定,成功表达VP1蛋白。随后基于PSV HNHB-01株全基因序列以及VP1基因序列与其他参考毒株的基因序列构建遗传进化树,分析遗传进化关系。结果表明:实验室分离的HNHB-01株与2017年分离的HNXX-01株亲缘关系最近,与日本株JPSV-1315关系接近;HNHB-01 VP1基因与国内2016-2017年流行的毒株HNXX-01、PSV-A2、JXXY-a2的VP1基因高度同源,与国外2009年流行的日本毒株JPSV1315的VP1基因亲缘关系较近;HNHB-01株VP1氨基酸与HNXX-01株VP1氨基酸同源性最高,同源性为99.32%。三级结构分析表明,VP1蛋白存在3条位于蛋白结构外侧的抗原表位区,对应的氨基酸序列分别为20~30 aa、90~100 aa和265~275 aa。本研究为PSV感染的诊断与预防提供依据,并为今后研究VP1基因的功能和开发疫苗奠定基础。

北京地区猫杯状病毒的分离鉴定及VP1基因序列分析

为了解猫杯状病毒(FCV)新流行毒株的流行情况、变异特点及致病性,通过收集2016-2022年4月北京地区多家宠物医院就诊疑似感染FCV的猫眼、鼻、咽拭子进行RT-PCR检测和分离培养,对分离到的5株FCV进行病毒含量测定、VP1基因序列分析,并对其中1株进行致病性试验。结果显示,2018-2022年4月阳性率分别为36.98%、34.30%、41.33%、40.46%和34.39%,总阳性率为37.93%。5株FCV分离株VP1基因核苷酸和氨基酸同源性分别为74.1%~85.4%和83.6%~91.0%;5株FCV分离株与国内疫苗株255株核苷酸和氨基酸同源性分别为74.8%~84.5%和83.7%~91.6%;与国内疫苗株255株、国外疫苗株F9株在不同的小分支上。致病性试验结果显示,猫感染BJH13株FCV后出现精神沉郁、食欲减退、体温升高、体重下降、眼鼻分泌物增多和舌泛红、溃疡等典型感染FCV临床症状;FCV感染猫的舌和肺脏组织病理切片结果显示,FCV侵染猫舌和肺脏并呈典型感染FCV病理特征。以上结果表明,FCV阳性率高;分离株BJH13株致病力强;FCV VP1基因序列变异大,与目前临床使用的疫苗株255、F9株VP1基因存在明显差异,存在疫苗免疫失败的风险。这对现阶段FCV防控带来了巨大挑战,同时为今后的疫苗研发提供了候选毒株和科学依据。

2021年中国部分地区鸡传染性贫血病毒VP1基因遗传变异分析

为全面了解鸡传染性贫血病毒(CIAV)在我国的流行情况和VP1基因遗传变异情况,研究对2021年全国25个省市421份疑似CIAV或其他病原感染的临床样本进行鉴定。结果显示,共有64份临床样本的VP1基因PCR鉴定为阳性,序列对分析发现有59株VP1基因位于基因A型分支,5株VP1基因位于基因C型分支,氨基酸位点分析发现第394位氨基酸为谷氨酰胺(Q),与3-1株、CAV-10株等高致病性CIAV一致,且第75、89、125、139、141、144位氨基酸位点也出现了不同程度的变异。研究表明目前我国鸡群流行的CIAV以A型为主,且VP1基因存在变异,结果为了解CIAV在我国的变异情况及传染性贫血防控提供了数据参考。

鸭病毒性肝炎病毒VP1基因表达及其抗体检测ELISA方法的建立

【目的】研究DHV VP1基因在大肠杆菌中的表达,并以纯化的重组蛋白为抗原建立鸭病毒性肝炎抗体检测ELISA方法。【方法】采用RT-PCR技术,扩增VP1基因,与pMD18-T载体进行连接,构建DHV VP1基因克隆重组质粒。然后定向插入到pET-32a(+)表达载体,筛选原核表达载体pET-32a-VP1,进行ITPG诱导表达分析。以纯化的重组蛋白为抗原建立间接ELISA方法并初步应用于临床。【结果】DHV VP1基因可在大肠杆菌中稳定、高效地表达。Western blot检测表明,表达的重组蛋白能与鸭肝炎阳性血清发生特异性反应。确定间接ELISA方法的抗原最佳包被浓度为5μg/孔,血清最佳稀释度为1∶100,临界值为OD450值≥0.302,建立的ELISA方法具有较好的敏感性、特异性和重复性。通过对80份血清样品的检测表明,该方法与中和试验的符合率为97.5%,初步临床应用结果表明该方法可用于雏鸭母源抗体和免疫后抗体的消长变化的检测。【结论】以大肠杆菌表达的DHV VP1重组蛋白为抗原建立的间接ELISA方法可用于鸭病毒性肝炎抗体的检测。

3株鸡传染性贫血病毒的分离鉴定、VP1基因遗传进化分析及致病性评价

为了解国内鸡场鸡传染性贫血(CIA)的流行状况和鸡传染性贫血病毒(CIAV)的遗传变异规律,以期对CIA的传播流行和预警防控提供技术支持。本试验对2020年在3个省份疑似发生CIA的3个规模鸡场采集10份组织脏器样品,应用鸡胚进行病毒的分离培养,并对培养物进行CIAV PCR检测,进而对CIAV阳性样本进行VP 1基因扩增和测序,应用Lasergene和MEGA 6.0软件,对获得的所有分离毒株结构蛋白VP 1基因序列与GenBank中CIAV参考毒株进行比对,构建系统发育进化树,同时对分离的CIAV毒株进行动物回归试验,评价其对鸡的致病性。结果显示,10份样品中3份为CIAV阳性,共分离到3株CIAV,分别命名为202006-NX-4-2、202006-SD-2-1和202006-JX-016。VP 1基因相似性分析显示,3株CIAV分离株核苷酸相似性介于97.7%~99.6%,且均与国内分离株具有较高同源性;氨基酸序列分析显示,3株CIAV分离株毒力相关位点均与国内强毒株GD-101株一致。遗传进化分析结果显示,3株分离株属于同一进化分支(Ⅱ分支),202006-SD-2-1株和202006-JX-016株与JL15120株进化关系最近,202006-NX-4-2株则与以国内强毒株GD-101株为代表的其他Ⅱ分支参考株进化关系最近。动物回归试验结果显示,3株CIAV均能够引起1日龄鸡发生严重的淋巴器官萎缩、骨髓黄化,为典型的高致病性病毒株特征。本试验结果为当前国内CIAV的流行、毒株的遗传变异分析及相关疫苗研发提供了参考依据。

2013～2014年杭州地区手足口病柯萨奇病毒A6型和A10型VP1基因特征分析

目的了解2013-2014年杭州地区手足口病病原谱的分布,并对其病原基因特征进行分析。方法采集2013年3月至2014年4月手足口病患儿标本1 340例,提取病毒核酸,通过逆转录和PCR扩增肠道病毒VP1序列并测序,经Blast比对确定病毒基因型。对柯萨奇病毒A6型（CA-A6）和A10型（CA-A10）VP1全长序列进行同源性比对分析,并构建系统进化树。结果1 340例手足口病患儿标本中,肠道病毒检出阳性率为81.43%（1 090/1 340）。其中,CV-A6阳性率为41.04%,取代EV-71（14.48%）成为杭州地区检出阳性率最高的肠道病毒;CV-A10检出率（8.51%）也高于CV-A16（3.81%）,列于第三位。同源性比对及系统进化分析显示,2013-2014年的25株CV-A6病毒核苷酸同源性为89.0%-99.7%,主要分布于G、H基因亚型;15株CV-A10病毒核苷酸同源性为95.3%-99.9%,分布于F、G基因亚型。结论 2013-2014年杭州地区儿童手足口病的主要病原体发生重大变化,CV-A6病毒成为最主要病原,CV-A10病毒也存在潜在威胁,需加强对其他肠道病毒的持续监测和分子特征分析。

番鸭细小病毒和鹅细小病毒广东株VP1基因的克隆与序列分析

参考GenBank中的MDPVFM株和GPVB株全基因序列 ,设计并合成一对引物 ,分别对MDPVGD株和GPVGD株的结构蛋白基因 (VP1)进行PCR扩增 ,并克隆到pMD18_T载体 ,筛选到重组质粒并测序。通过对MDPVGD株和GPVGD株的VP1基因的核苷酸序列分析 ,这两种病毒VP1基因大小均为 2 199bp ,核苷酸序列同源性为 87% ,而位于VP1基因上的VP2至VP3基因起始密码子之间的核苷酸序列的差异较大 ,同源性仅为 6 4 %。另外对MDPVGD株和GPVGD株与各地方毒株的VP1和VP3基因核苷酸序列的同源性比较 。

口蹄疫病毒VP1基因在番茄中的表达及转基因番茄对豚鼠诱导免疫保护

构建克隆有O型口蹄疫病毒China99株VP1基因的植物双元表达载体pBin438/VP1。通过农杆菌介导法转化番茄子叶,经卡那霉素抗性筛选,获得60株抗性植株。对抗性植株分别做PCR、RT-PCR检测目的基因的整合与转录,ELISA筛选约40%的卡那抗性植株阳性,分别提取两株ELISA和Western blot检测阳性的转基因番茄叶片蛋白与弗氏佐剂乳化,于0、15、30d经肌肉途径免疫豚鼠,第三次免疫后28d用100ID50的同源强毒攻击,根据豚鼠抗体水平的消长动态和免疫豚鼠抗强毒攻击的保护率进行转基因植物疫苗免疫原性的评估。结果表明,双元表达载体pBin438/VP1构建正确,PCR、RT-PCR结果证实口蹄疫病毒VP1基因已整合到番茄基因组并在转录水平表达,ELISA和Western blot检测重组蛋白能够与FMDV阳性血清反应。转基因番茄第三次免疫豚鼠后21d血清效价最高可达1∶64,攻毒后两组免疫豚鼠保护率分别达80%和40%,证明转基因番茄表达的VP1蛋白具有良好的免疫原性。

口蹄疫病毒VP1基因的原核表达及免疫原性检测

将口蹄疫病毒VP1基因克隆至原核表达载体 pBAD/TOPO中 ,经鉴定后得到了重组质粒 pBAD VP1。将此重组质粒转化到受体菌TOP10中 ,分别以不同浓度的诱导剂L 阿拉伯醛糖进行诱导 ,并在不同诱导时间进行采样 ,经处理后做SDS PAGE和蛋白质印迹分析。结果 ,以终浓度为 0 .0 2 g/L的L 阿拉伯醛糖进行诱导 ,4h后表达可达到高峰 ,表达产物大小约为 4 0ku。软件扫描结果显示 ,VP1融合蛋白的表达量占细菌总蛋白的 2 6 .3% ,能与抗FMDV抗体发生特异性反应 ,融合蛋白以包涵体和可溶形式存在。抽提融合蛋白的包涵体 ,经过洗涤后制成油乳剂疫苗 ,经皮下注射免疫豚鼠 ,用乳鼠中和试验测定豚鼠血清中和指数 ,并用口蹄疫病毒对豚鼠进行攻毒。结果表明 ,用此融合蛋白的包涵体免疫豚鼠能诱导产生中和抗体 ,并对病毒的攻击提供免疫保护。

5株猪O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因的克隆与序列分析

提取5株猪O型口蹄疫病毒(FMDV)(L1～L5)的RNA,用1对通用引物经RT PCR法扩增了5株病毒VP1基因的DNA片段.克隆后通过测序获得其核苷酸序列,分析表明,除L2株外,其余4株(L1、L3、L4和L5)VP1基因的核苷酸序列同源性在96 7%～99 8%,氨基酸序列同源性在99 5%～100%;而L2株与L1、L3、L4和L5株VP1基因的核苷酸序列同源性在82 0%～83 4%,氨基酸序列同源性在89 7%～90 1%.L1、L3、L4和L5株病毒VP1基因的核苷酸序列与已经发表的GD/CHA/86、HKN/1/99、HKN/16/96的同源性较高,核苷酸序列同源性在85 0%～99 8%,属于同一基因型;而与L2、F29/CHINA及国外大多数毒株相比,属于不同的基因型,其核苷酸序列同源性仅为41 0%～82 6%.5株毒株中的L1、L3、L4和L5的主要中和抗原位点140～160、200～213位氨基酸序列完全相同,推测其有相近的中和单抗表位和相同的抗原性.

新型鸭肝炎病毒的分离鉴定及VP1基因序列分析

为了解新型鸭肝炎病毒(N-DHV)的变异情况,本实验从广西、河南、山东临床发病鸭体内分离到3株病毒。通过RT-PCR检测为N-DHV。将分离株进行鸭胚传代培养,并测定鸭胚毒的ELD50为10-3.29/0.2 mL～10-4.65/0.2 mL。以1型和N-DHV阳性血清分别与分离株进行血清交叉中和试验,结果表明,Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-1)阳性血清对分离株无保护性。动物回归试验表明,分离株致死雏鸭的临床症状和病变与DHV-1相同,分离株的致死率为30%～70%。将分离株接种鸡胚,不产生任何病变,在鸡胚成纤维细胞中连续传5代后,细胞产生明显、规律的病变。扩增3株分离株的VP1基因,并进行氨基酸序列比对,结果表明3个分离株与DHV-C的同源性最高,与DHV-A的同源性最低,并存在氨基酸的插入和缺失。本实验表明3个分离株与韩国N-DHV属于同一血清型。

O型口蹄疫病毒VP1基因的克隆与表达

以O型口蹄疫病毒(FMDV)流行毒株为研究对象,通过RT PCR扩增出VP1基因,克隆至表达载体pET 32a中,分析比较不同地区O型口蹄疫病毒VP1基因序列,为构建VP1重组基因工程苗奠定基础.经测序表明,目的基因VP1已以正确的阅读框架整合至表达质粒中,应用大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌,通过IPTG诱导方法,表达包含VP1基因产物的融合蛋白,经SDS PAGE和Western blotting分析,表明表达蛋白表达量高,反应原性良好.

鸡贫血病毒VP1基因在大肠杆菌中的高效表达及其生物学特性的初步分析

将鸡贫血病毒 (CAV)VP1蛋白 44 9个氨基酸中的 42 4个氨基酸 (占 95 % )编码序列分二段 ,分别克隆入表达性载体 pGEX - 5X - 3,在大肠杆菌以GST融合蛋白的形式获得了高效表达。以表达产物免疫小鼠 4次 ,制备了抗CAV的多克隆抗体。通过对CAV感染的MSB1细胞做间接免疫荧光试验 (IFA) ,结果为阳性。这表明表达物保留了天然VP1相关的抗原性。用此抗CAV抗体和所建立的IFA方法对临床CAV凝似病料成功地进行了实验室诊断。

柯萨奇B3病毒VP1基因在大肠杆菌中的表达

本文通过融合柯萨奇Ｂ３病毒（ＣＶＢ３））ＶＰ１基因与人凝血酌基因，仗ＣＶＢ３的ＶＰ１在大肠杆菌中得到稳定的表达。经蛋白扫描仪等测定，表达的融合蛋白占菌体可溶性蛋白的１１％左右。表达的ＶＰ１产物勺抗ＣＶＢ３ＶＰ１单克隆抗体和小鼠抗ＣＶＢ３血清产生较强的免疫反应，与天然的ＣＶＢ３蛋白抗原性相同。应用无关单抗和载体质粒对照均呈现阴性反应。应用表达的ＶＰ１作为抗原，我们对临床部分急性病毒性心肌炎患者血清进行了特异性ＩｇＭ免疫印迹法检测，其结果与组织培养的ＣＶＢ３制备的蛋白抗原对患者血清的特异性ＩｇＭ反应基本一致。采用基因上程方法制备ＣＶＢ３抗原产最高，易纯化，免疫原性没有改变。故可以试用表达的ＶＰ１抗原代替目的有实验室感染危险的病毒培养及抗原制备方法，快速、特异地诊断ＣＶＢ３感染。

鸭病毒性肝炎病毒分离鉴定及VP1基因序列分析

应用无母源抗体的鸭胚从疑似病毒性鸭肝炎的病麻鸭肝脏中分离到1株病毒。该分离毒能致死鸡胚、番鸭胚和麻鸭胚,死胚尿囊液均无血凝性;病毒能被鸭病毒性肝炎高免血清特异性中和;病毒人工感染3日龄麻鸭发病率和死亡率均达50%,并从病死鸭肝脏中回收到分离毒;RT-PCR扩增结果表明分离毒为I型DHV阳性,同时将此扩增的1 052 bp目的片段克隆到pMD18-T载体,对重组阳性质粒进行序列测定和分析表明分离毒的VP1基因与台湾省分离株DHV-03D的亲缘关系最近,同源率为95.7%,对VP1氨基酸潜在位点分析发现该分离毒具有野毒的分子特征。上述结果表明该分离毒为Ⅰ型鸭肝炎病毒,命名为DHV-NA株。

FMDV VP1基因与HSP70基因在毕赤酵母中的融合表达及免疫特性

利用毕赤酵母系统对O型口蹄疫病毒VP1基因与结核杆菌HSP70基因进行融合表达,并检测此融合蛋白对小鼠细胞免疫和体液免疫的影响。将人工合成的O型口蹄疫病毒VP1基因与结核杆菌HSP70基因克隆入酵母表达载体pPICZαA中,以电穿孔法转化酵母菌X-33,用Zeocin+YPDS平板筛选重组子,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物。以皮下接种的方式给小鼠进行3次免疫,同时设两组对照,分别免疫PBS和常规灭活疫苗,然后通过MTT法和ELISA分别检测淋巴细胞的增殖情况和抗体水平。结果表明融合蛋白既能诱导细胞免疫应答又能诱导体液免疫应答,其诱导产生的抗体水平略低于常规灭活疫苗,而细胞免疫水平则高于后者。